20 Tabel 2. Komposisi czapek’s nutrient medium
Nama Bahan Jumlah
Air destilata 1 L
NaNO3 30 g
KCl 5 g
MgSO4.7H2O 5 g
FeSO4.7H2O 0.1 g
3.2.3.2 Persiapan Isolat Aspergillus ustus
Persiapan isolat dilakukan dalam tiga tahap, yaitu penumbuhan, peremajaan isolat, dan pengenceran isolat. Penumbuhan isolat Aspergillus ustus bertujuan untuk mendapatkan stock
isolat untuk produksi enzim pektinase, sedangkan peremajaan isolat bertujuan untuk memperoleh isolat yang segar untuk produksi enzim pektinase. Isolat Aspergillus ustus yang digunakan untuk
produksi enzim pektinase adalah isolat yang berumur lima hari. Media penumbuhan dan peremajaan Aspergillus ustus berupa media agar. Komposisi
media agar terdiri dari air destilata, pektin komersial, bahan-bahan mineral NH
4 2
HPO
4
, KH
2
PO
4
, K
2
HPO
4
, dan MGSO
4
.7H
2
O, dan purified agar. Pembuatan media penumbuhan dan peremajaan isolat Aspergillus ustus dapat dilihat pada Lampiran 1.
Media agar steril yang telah dibuat kemudian diinokulasikam isolat Aspergillus ustus menggunakan ose steril dan dilakukan di dalam laminar yang telah disinari UV ultraviolet
selama 15 menit untuk menghindari kontaminasi. Media agar steril yang ditempatkan di dalam cawan petri digunakan untuk penumbuhan isolat Aspergillus ustus untuk stock isolat, sedangkan
yang ditempatkan di dalam tabung reaksi agar miring digunakan untuk peremajaan Aspergillus ustus
. Pengenceran isolat Aspergillus ustus bertujuan untuk memperoleh inokulum yang akan
digunakan untuk produksi enzim pektinase. Isolat Aspergillus ustus yang diencerkan berasal dari hasil isolat Aspergillus ustus yang diremajakan dan berumur lima hari. Pengenceran isolat
menggunakan air destilata steril sebanyak 5 mL yang dicampurkan ke dalam isolat Aspergillus ustus
yang diremajakan.
3.2.3.3 Produksi Enzim Pektinase
Produksi enzim pektinase dimulai dengan menginokolukasikan isolat Aspergillus ustus hasil pengenceran ke dalam media fermentasi semi padat steril yang telah dibuat kultur. Isolat
diambil sebanyak 250 µL menggunakan pipet mikro dan dipindahkan ke dalam masing-masing erlenmeyer yang berisi media fermentasi semi padat. Media fermentasi semi padat yang telah
berisi isolat ditutup dengan kapas steril untuk memudahkan CO
2
yang diproduksi selama
21 GP x FP x 1000
t x BM fermentasi terlepas atau keluar Baladhandayutham dan Thangavelu 2011. Produksi enzim
pektinase ini dilakukan sebanyak dua ulangan untuk masing-masing kultur. Produksi enzim pektinase dilakukan pada suhu ruang selama 7 hari mulai dari hari ke-0
hingga hari ke-7 untuk masing-masing jenis substrat media fermentasi semi padat. Setiap 24 jam sekali 1 hari, kultur yang difermentasi dipindahkan dari ruang fermentasi ke lemari pendingin
chiller untuk menghentikan aktivitas Aspergillus ustus. Produksi enzim pektinase yang pertama dilakukan untuk mendapatkan substrat terbaik,
yaitu jenis limbah pertanian mana yang dapat dijadikan media fermentasi sehingga menghasilkan aktivitas enzim pektinase tertinggi dan hasilnya akan digunakan untuk tahap selanjutnya. Produksi
enzim pektinase selanjutnya adalah untuk tahap optimasi kondisi fermentasi, yaitu untuk mengetahui kondisi optimal pada saat fermentasi sehingga didapatkan aktivitas enzim pektinase
tertinggi.
3.2.3.4 Pengukuran Aktivitas Enzim Pektinase
Analisis aktivitas enzim dilakukan dengan penambahkan air destilata sebanyak 15 mL ke dalam masing-masing kultur kemudian diaduk menggunakan magnetic stirrer suhu selama
pengadukan harus tetap dingin agar enzim tidak rusak selama 15 menit. Hal ini bertujuan untuk mengekstraksi enzim pektinase ekstraseluler yang terbentuk. Enzim yang terekstrak kemudian
dipipet dengan pipet mikro sebanyak 1500 µL dan dipindahkan ke dalam microtube eppendorf. Tahap selanjutnya yaitu sentrifugasi ekstrak enzim menggunakan sentrifuse dengan kecepatan
11.000 rpm selama 20 menit, dari proses ini akan terbentuk enzim pektinase kasar crude enzyme berupa supernatan atau filtrat serta biomassa dan sel endapan.
Enzim pektinase kasar digunakan untuk analisis aktivitas enzim dengan cara melakukan pengenceran 10
2
. Aktivitas enzim didapat dengan melakukan pengukuran nilai absorbansi crude enzim yang telah direaksikan dengan larutan substrat pektin komersial dan dihentikan reaksinya
oleh DNS dinitrosalisilat setelah reaksi berlangsung selama 30 menit, kemudian dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm, absorbansi enzim tersebut
diukur. Tahapan pengukuran aktivitas enzim dengan spektrofotometer secara skematis dapat dilihat pada Lampiran 3. Nilai absorbansi yang didapat dikonversi menjadi konsentrasi gula
pereduksi ppm menggunakan persamaan yang didapat dari kurva standar asam galakturonat Lampiran 4 kemudian dihitung nilai aktivitas enzim pektinase menggunakan rumus berikut
persamaan 1.7 AE =
1.7
22 Keterangan :
AE : Aktivitas enzim pektinase kasar UmL
[GP] : Konsentrasi gula pereduksi yang diperoleh dari kurva standar mgmL
1000 : Faktor
konversi FP :
Faktor pengenceran
t : Waktu inkubasi menit
BM : Bobot molekul asam galakturonat 212 gmol
Aktivitas enzim pektinase dinyatakan dalam UmL. Satu unit merupakan jumlah enzim yang dibutuhkan untuk memecah 1 µmol pektin menjadi asam galakturonat per menit pada kondisi
pengujian.
3.2.4 Pengujian Kondisi Optimum Produksi Enzim Pektinase