Produksi Enzim Pektinase Pengukuran Aktivitas Enzim Pektinase

20 Tabel 2. Komposisi czapek’s nutrient medium Nama Bahan Jumlah Air destilata 1 L NaNO3 30 g KCl 5 g MgSO4.7H2O 5 g FeSO4.7H2O 0.1 g

3.2.3.2 Persiapan Isolat Aspergillus ustus

Persiapan isolat dilakukan dalam tiga tahap, yaitu penumbuhan, peremajaan isolat, dan pengenceran isolat. Penumbuhan isolat Aspergillus ustus bertujuan untuk mendapatkan stock isolat untuk produksi enzim pektinase, sedangkan peremajaan isolat bertujuan untuk memperoleh isolat yang segar untuk produksi enzim pektinase. Isolat Aspergillus ustus yang digunakan untuk produksi enzim pektinase adalah isolat yang berumur lima hari. Media penumbuhan dan peremajaan Aspergillus ustus berupa media agar. Komposisi media agar terdiri dari air destilata, pektin komersial, bahan-bahan mineral NH 4 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , dan MGSO 4 .7H 2 O, dan purified agar. Pembuatan media penumbuhan dan peremajaan isolat Aspergillus ustus dapat dilihat pada Lampiran 1. Media agar steril yang telah dibuat kemudian diinokulasikam isolat Aspergillus ustus menggunakan ose steril dan dilakukan di dalam laminar yang telah disinari UV ultraviolet selama 15 menit untuk menghindari kontaminasi. Media agar steril yang ditempatkan di dalam cawan petri digunakan untuk penumbuhan isolat Aspergillus ustus untuk stock isolat, sedangkan yang ditempatkan di dalam tabung reaksi agar miring digunakan untuk peremajaan Aspergillus ustus . Pengenceran isolat Aspergillus ustus bertujuan untuk memperoleh inokulum yang akan digunakan untuk produksi enzim pektinase. Isolat Aspergillus ustus yang diencerkan berasal dari hasil isolat Aspergillus ustus yang diremajakan dan berumur lima hari. Pengenceran isolat menggunakan air destilata steril sebanyak 5 mL yang dicampurkan ke dalam isolat Aspergillus ustus yang diremajakan.

3.2.3.3 Produksi Enzim Pektinase

Produksi enzim pektinase dimulai dengan menginokolukasikan isolat Aspergillus ustus hasil pengenceran ke dalam media fermentasi semi padat steril yang telah dibuat kultur. Isolat diambil sebanyak 250 µL menggunakan pipet mikro dan dipindahkan ke dalam masing-masing erlenmeyer yang berisi media fermentasi semi padat. Media fermentasi semi padat yang telah berisi isolat ditutup dengan kapas steril untuk memudahkan CO 2 yang diproduksi selama 21 GP x FP x 1000 t x BM fermentasi terlepas atau keluar Baladhandayutham dan Thangavelu 2011. Produksi enzim pektinase ini dilakukan sebanyak dua ulangan untuk masing-masing kultur. Produksi enzim pektinase dilakukan pada suhu ruang selama 7 hari mulai dari hari ke-0 hingga hari ke-7 untuk masing-masing jenis substrat media fermentasi semi padat. Setiap 24 jam sekali 1 hari, kultur yang difermentasi dipindahkan dari ruang fermentasi ke lemari pendingin chiller untuk menghentikan aktivitas Aspergillus ustus. Produksi enzim pektinase yang pertama dilakukan untuk mendapatkan substrat terbaik, yaitu jenis limbah pertanian mana yang dapat dijadikan media fermentasi sehingga menghasilkan aktivitas enzim pektinase tertinggi dan hasilnya akan digunakan untuk tahap selanjutnya. Produksi enzim pektinase selanjutnya adalah untuk tahap optimasi kondisi fermentasi, yaitu untuk mengetahui kondisi optimal pada saat fermentasi sehingga didapatkan aktivitas enzim pektinase tertinggi.

3.2.3.4 Pengukuran Aktivitas Enzim Pektinase

Analisis aktivitas enzim dilakukan dengan penambahkan air destilata sebanyak 15 mL ke dalam masing-masing kultur kemudian diaduk menggunakan magnetic stirrer suhu selama pengadukan harus tetap dingin agar enzim tidak rusak selama 15 menit. Hal ini bertujuan untuk mengekstraksi enzim pektinase ekstraseluler yang terbentuk. Enzim yang terekstrak kemudian dipipet dengan pipet mikro sebanyak 1500 µL dan dipindahkan ke dalam microtube eppendorf. Tahap selanjutnya yaitu sentrifugasi ekstrak enzim menggunakan sentrifuse dengan kecepatan 11.000 rpm selama 20 menit, dari proses ini akan terbentuk enzim pektinase kasar crude enzyme berupa supernatan atau filtrat serta biomassa dan sel endapan. Enzim pektinase kasar digunakan untuk analisis aktivitas enzim dengan cara melakukan pengenceran 10 2 . Aktivitas enzim didapat dengan melakukan pengukuran nilai absorbansi crude enzim yang telah direaksikan dengan larutan substrat pektin komersial dan dihentikan reaksinya oleh DNS dinitrosalisilat setelah reaksi berlangsung selama 30 menit, kemudian dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm, absorbansi enzim tersebut diukur. Tahapan pengukuran aktivitas enzim dengan spektrofotometer secara skematis dapat dilihat pada Lampiran 3. Nilai absorbansi yang didapat dikonversi menjadi konsentrasi gula pereduksi ppm menggunakan persamaan yang didapat dari kurva standar asam galakturonat Lampiran 4 kemudian dihitung nilai aktivitas enzim pektinase menggunakan rumus berikut persamaan 1.7 AE = 1.7 22 Keterangan : AE : Aktivitas enzim pektinase kasar UmL [GP] : Konsentrasi gula pereduksi yang diperoleh dari kurva standar mgmL 1000 : Faktor konversi FP : Faktor pengenceran t : Waktu inkubasi menit BM : Bobot molekul asam galakturonat 212 gmol Aktivitas enzim pektinase dinyatakan dalam UmL. Satu unit merupakan jumlah enzim yang dibutuhkan untuk memecah 1 µmol pektin menjadi asam galakturonat per menit pada kondisi pengujian.

3.2.4 Pengujian Kondisi Optimum Produksi Enzim Pektinase