Alat Bahan Bagan Penelitian

BAB 3 METODOLOGI

3.1 Alat

- Fermentor - PH meter HANNA - Cawan petri - Gelas ukur Pyrex - Jarum ose - Tabung reaksi - Bunsen - Hockey stick - Oven - Autoclave YAMATO - Neraca analitis Mettler Toledo - Vortex Fisons WhirliMixer - Hot plate - Penangas air - Mikroskop Griffin Carton - Erlenmeyer - Pipet serologi - Kaca objek - Bola karet - Polarimeter KRUSS - Centrifuge Dynamic, Thermo Scientific Fisher - Buret Pyrex - Labu takar Pyrex - Pipet tetes Universitas Sumatera Utara - Spectrophotometer UV-Vis Cary 50

3.2 Bahan

- D-sorbitol p.a - Yeast extract p.a - MgSO 4 .7H 2 - NH O p.a 4 H 2 PO 4 - Agar p.a - Plate Count Agar p.a - Triple Sugar Iron Agar p.a - Simmons Citrate Agar p.a - SIM Medium p.a - Gelatin p.a - Starch p.a - H 2 O 2 - Sukrosa p.a - Etanol aq - NH 4 2 SO 4 - K p.a 2 HPO 4 - Larutan iodium aq p.a - Asam asetat glasial aq - Larutan kristal ungu aq - Indikator amilum - Larutan iodin aq - Larutan safranin aq - NaOH s - Asam askorbat s - Akuades Universitas Sumatera Utara - Starter air kelapa 3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Preparasi Media dan Pembuatan Larutan Pereaksi untuk Identifikasi Bakteri Acetobacter xylinum

3.3.1.1 Pembuatan Media Hassid Barker Agar HBA

Ditimbang 10 gram sukrosa; 0,06 gram NH 4 2 SO 4 ; 0,5 gram K 2 HPO 4 ; 0,25 gram yeast extract; 2 mL asam asetat glasial 1,96 dan 6 gram agar lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer kemudian dilarutkan dalam 100 mL akuades.

3.3.1.2 Pembuatan Media Sorbitol 50 gL

Ditimbang 12,5 gram sorbitol lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer kemudian dilarutkan dalam 250 mL akuades.

3.3.1.3 Pembuatan Media Sorbitol 100 gL

Ditimbang 25 gram sorbitol lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer kemudian dilarutkan dalam 250 mL akuades.

3.3.1.4 Pembuatan Media Sorbitol 150 gL

Ditimbang 37,5 gram sorbitol lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer kemudian dilarutkan dalam 250 mL akuades.

3.3.1.5 Pembuatan Media Plate Count Agar PCA

Ditimbang 2,3 gram media PCA lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer kemudian dilarutkan dalam 100 mL akuades. Universitas Sumatera Utara

3.3.1.6 Pembuatan Larutan Triple Sugar Iron Agar TSIA

Ditimbang 0,65 gram media TSIA lalu dimasukkan ke dalam gelas beaker kemudian dilarutkan dalam 10 mL akuades.

3.3.1.7 Pembuatan Larutan Simmons Citrate Agar SCA

Ditimbang 0,23 gram media SCA lalu dimasukkan ke dalam gelas beaker kemudian dilarutkan dalam 10 mL akuades.

3.3.1.8 Pembuatan Larutan SIM Sulfide Indole Motility Medium

Ditimbang 0,3 gram media SIM lalu dimasukkan ke dalam gelas beaker kemudian dilarutkan dalam 10 mL akuades.

3.3.1.9 Pembuatan Larutan Gelatin

Ditimbang 1,26 gram Gelatin lalu dimasukkan ke dalam gelas beaker kemudian dilarutkan dalam 10 mL akuades.

3.3.1.10 Pembuatan Media Starch

Ditimbang 0,03 gram Starch dan 0,3 gram agar lalu dimasukkan ke dalam gelas beaker kemudian dilarutkan dalam 10 mL akuades.

3.3.1.11 Pembuatan Larutan Asam Asetat Glasial 1,96

Diukur 1 mL asam asetat glasial 100 lalu dimasukkan ke dalam botol reagen kemudian dilarutkan dalam 50 mL akuades. Universitas Sumatera Utara

3.3.1.12 Pembuatan Larutan Vitamin C Standar

Ditimbang 0,25 gram vitamin C lalu dimasukkan ke dalam ke dalam botol reagen kemudian dilarutkan dalam 250 mL akuades. 3.3.2 Perlakuan terhadap Sampel dan Metoda Pengukuran Sampel 3.3.2.1 Identifikasi Bakteri Acetobacter xylinum dengan Metoda Pewarnaan Gram Dibuat preparat untuk penempatan bakteri kemudian disterilkan di atas api. Lalu diberikan kristal ungu selama 1 menit dan dimiringkan kaca objek di atas bak pewarna kemudian dibilas dengan akuades. Ditiriskan kaca objek di atas kertas serap dan ditempatkan di atas rak pada bak pewarna. Diberikan larutan iodium selama 2 menit dan dimiringkan kaca objek kemudian dibilas dengan akuades. Dicuci dengan etanol setetes demi setetes selama 30 detik sampai zat warna kristal ungu, tidak terlihat lagi lalu dicuci dengan akuades kemudian ditiriskan dan ditempatkan di atas rak pada bak pewarna. Diberikan safranin selama 30 detik pada kaca objek kemudian dibilas dengan air. Ditiriskan kaca objek dan diserap kelebihan akuades pada olesan dengan menekankan kertas serap. Diamati di bawah mikroskop dengan lensa objektif lalu dicatat hasilnya.

3.3.2.2 Penentuan Jumlah Koloni Bakteri dengan Metoda Hitungan Cawan

Ditimbang 2,3 gram media PCA lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer kemudian dilarutkan dalam 100 mL akuades. Diencerkan media PCA pada erlenmeyer dalam air mendidih lalu didinginkan agar dalam penangas air kemudian dituangkan masing- masing sebanyak 10 mL media PCA pada 2 buah cawan petri dan dibiarkan sampai dingin. Dibuat pengenceran dari sampel lalu dimasukkan 6,5x10 5 koloni bakteri kemudian diratakan dengan menggunakan alat penyebar untuk meratakan suspensi di atas permukaan lempengan agar kemudian dibalikkan cawan petri dan dimasukkan ke inkubator selama 24 jam. Dihitung jumlah mikroba hidup dengan mengalikan faktor pengenceran yang digunakan. Diamati hasilnya. Universitas Sumatera Utara

3.3.2.3 Pembuatan Starter

Ditimbang 0,5 gram sorbitol; 0,5 gram yeast extract; 0,3 gram NH 4 H 2 PO 4 dan 0,1 gram MgSO 4 ke dalam 250 mL gelas erlenmeyer lalu dilarutkan dengan 100 mL akuades sedikit demi sedikit sampai semua larut. Ditambahkan 6,5x10 5 koloni bakteri stok kultur Acetobacter xylinum lalu dimasukkan ke dalam inkubator, kemudian diatur pada temperatur kamar. Proses inilah yang menjadi standard liquid media.

3.3.2.4 Pembuatan Larutan Fermentasi D-Sorbitol menjadi Vitamin C

Ditimbang 1,25 gram yeast extract; 0,75 gram NH 4 H 2 PO 4 dan 0,25 gram MgSO 4 ke dalam 250 mL gelas erlenmeyer lalu dilarutkan dengan 250 mL akuades sebagai media nutrisi. Ditambahkan 100 mL larutan starter standard liquid media dan 250 mL sorbitol 50 gL ke dalam alat fermentor sistem batch culture teraduk kontinu lalu disambungkan pengaduk elektriknya dengan sumber arus kemudian dilakukan fermentasi selama 72 jam dan diatur pH 4-4,5. Dilakukan tes kualitatif terhadap larutan fermentasi, bila hasil tes + maka dilakukan pemanenan dengan cara sentrifuge sehingga diperoleh filtratnya. Ditentukan konsentrasi vitamin C dengan metoda Polarimetri, metoda Spektrofotometri UV-Visible dan metoda Titrasi Iodometri. Diulangi perlakuan yang sama pada 100 gL dan 150 gL sorbitol. lalu diamati hasilnya.

3.3.2.5 Penentuan Vitamin C dengan Metoda Polarimetri

Disambungkan alat polarimeter dengan sumber arus. Diisi 10 mL akuades pada tabung polarimeter hingga terisi penuh dan tidak ada gelembung udara di dalamnya. Dimasukkan ke dalam alat polarimeter. Ditentukan titik nol dengan memutar knop sambil mengatur alat putar hingga mendapatkan warna segelap mungkin lalu diganti dengan larutan fermentasi 50 gL dan diputar knop pelan-pelan ke kiri. Dicatat skala analisator dan diputar ke kiri. Dilakukan perlakuan yang sama pada larutan fermentasi 100 gL dan 150 gL. Universitas Sumatera Utara

3.3.2.6 Pemanenan Hasil Larutan Fermentasi dengan Metoda Sentrifuge

Dimasukkan tabung sentrifuge yang berisi 9 mL larutan fermentasi 50 gL ke dalam rotor lalu dikunci rapat penutup rotor kemudian ditutup penutup alat sentrifuge dengan rapat dan ditekan tombol start untuk memulai proses pemusingan yang telah disambungkan ke sumber arus. Jika sudah selesai, dibuka penutup alat sentrifuge dengan penutup rotor lalu dikeluarkan sampel kemudian dibersihkan tabung sentrifuge dengan menggunakan tisu sehingga diperoleh produk dalam bentuk larutan. Dilakukan perlakuan yang sama pada larutan fermentasi 100 gL dan 150 gL.

3.3.2.7 Penentuan Vitamin C dengan Metoda Spektrofotometri UV-Visible

Dimasukkan akuades ke dalam kuvet kosong berdiameter 1 cm lalu dihindari terbentuk gelembung udara kemudian dikeringkan bagian luar tube. Dimasukkan kuvet lalu diukur hasil pengukuran blanko yang telah disambungkan ke sumber arus. Dilakukan pengukuran sampel dengan mengganti isi kuvet dengan larutan fermentasi 50 gL lalu dihindari terbentuk gelembung udara kemudian dibersihkan dan dikeringkan bagian luar kuvet. Dimasukkan kuvet lalu diukur hasil pengukuran larutan fermentasi 50 gL kemudian dicatat hasilnya. Dilakukan perlakuan yang sama pada larutan fermentasi 100 gL dan 150 gL.

3.3.2.8 Penentuan Vitamin C dengan Metoda Titrasi Iodometri

Dimasukkan 10 mL larutan fermentasi 50 gL ke dalam labu takar 100 mL lalu diencerkan dengan akuades dalam labu takar 100 mL hingga garis batas kemudian dihomogenkan. Dimasukkan 10 mL larutan fermentasi 50 gL yang sudah diencerkan ke dalam erlenmeyer dengan menggunakan pipet volum lalu ditambahkan 3 tetes indikator amilum kemudian dititrasi dengan larutan I 2 0,01 N hingga terjadi perubahan warna dari bening menjadi biru pada titik akhir titrasi dan dicatat volume titrasi yang terpakai. Diulangi percobaan yang sama sebanyak 3 kali lalu dicatat hasil yang Universitas Sumatera Utara diperoleh. Dilakukan perlakuan yang sama pada larutan fermentasi 100 gL dan 150 gL. Universitas Sumatera Utara

3.4 Bagan Penelitian

ditambahkan 0,1 mL substrat starter air kelapa dimasukkan ke dalam inkubator diuji dengan Metode Pewarnaan Gram dimasukkan 2,25 gram dimasukkan 0,5 gram sorbitol; sorbitol; 2,25 gram yeast extract; 1,35 gram 0,5 gram yeast extract; NH 4 H 2 PO 4; 0,45 gram MgSO 4 dan 0,3 gram NH 4 H 2 PO 4 9 gram agar 0,1 gram MgSO dan dilarutkan dalam 450 mL akuades dilarutkan dalam 100 mL 4 dimasukkan ke dalam inkubator akuades dimasukkan ke dalam inkubator dimasukkan 250 mL media nutrisi dimasukkan dimasukkan dimasukkan 250 mL sorbitol 250 mL sorbitol 250 mL sorbitol 50 gL 100 gL 150 gL dimasukkan ke dalam fermenter selama 72 jam disentrifuge Hassid Barker Agar HBA Bakteri Acetobacter xylinum Culture Maintenance Media Standard Liquid Media Larutan Fermentasi 50 gL Larutan Fermentasi 100 gL Larutan Fermentasi 150 gL Uji Polarimeter Uji Spektrofotometer UV-Visible Uji Titrasi Iodometri Uji Hitungan Cawan Universitas Sumatera Utara Uji Polarimeter disambungkan dengan sumber arus dimasukkan 10 mL akuades pada tabung polarimeter hingga terisi penuh dan tidak ada gelembung udara di dalamnya ditentukan titik nol dengan memutar knop sambil mengatur alat putar hingga mendapatkan warna segelap mungkin diganti akuades dengan larutan fermentasi 50 gL diputar knop pelan-pelan ke kiri dicatat analisator dan diputar ke kiri dilakukan perlakuan yang sama pada larutan fermentasi 100 gL dan 150 gL Alat Polarimeter Hasil Universitas Sumatera Utara Uji Hitungan Cawan dimasukkan ke dalam erlenmeyer dilarutkan dalam 100 mL akuades diencerkan didinginkan dituangkan masing-masing 10 mL media PCA ke dalam 2 buah cawan petri dibiarkan sampai dingin dimasukkan 6,5x10 5 diratakan suspensi dengan menggunakan alat penyebar koloni bakteri yang telah diencerkan dengan sampel dibalikkan cawan petri dimasukkan ke dalam inkubator selama 24 jam dihitung jumlah mikroba dengan mengalikan faktor pengenceran 2,3 gram media PCA Hasil Universitas Sumatera Utara Uji Spektrofotometer UV-Vis dimasukkan akuades tanpa adanya gelembung udara dimasukkan ke dalam alat spektrofotometer UV-Vis disambungkan dengan sumber arus diukur hasil pengukuran blanko diganti akuades dengan larutan fermentasi 50 gL diukur hasil pengukuran sampel dilakukan perlakuan yang sama pada larutan fermentasi 100 gL dan 150 gL Kuvet berdiameter 10 cm Hasil Universitas Sumatera Utara Uji Titrasi Iodometri dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL diencerkan dengan akuades hingga garis batas dihomogenkan ditambahkan 3 tetes indikator amilum dititrasi dengan larutan I 2 dicatat volume titrasi yang dipakai 0,01N hingga terjadi perubahan warna dari bening menjadi biru pada titik akhir titrasi diulangi perlakuan yang sama pada larutan fermentasi 100 gL dan 150 gL 10 mL larutan fermentasi 50 gL Hasil Universitas Sumatera Utara Metoda Pemanenan Hasil Fermentasi Pra-perlakuan Fermentasi Pemisahan biomassa Isolasi produk Purifikasi produk Formulasi Produk Uji Biokimia Bakteri Acetobacter xylinum Bakteri Acetobacter xylinum Uji TSIA Uji SCA Uji SIM Uji Gelatin Uji Starch + Agar Uji H 2 O 2 3 Universitas Sumatera Utara

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

Hasil analisa yang dilakukan terhadap D-sorbitol dapat dilihat pada 4.2.1 - 4.2.4. 4.2 Perhitungan 4.2.1 Penentuan Vitamin C dengan Metoda Polarimetri Sudut putar bidang polarisasi cahaya hasil pembacaan pada alat polarimeter Volume Larutan Fermentasi ° ° 10 mL - 0,015 - 0,23 10 mL - 0,54 10 mL - 0,525 Volume Larutan Fermentasi yang diamati mL Total Volume Fermentasi mL Konsentrasi Vitamin C standar gL ° ° Konsentrasi Vitamin C Hasil Pengamatan gL 10 600 1 - 0,015 - 0,23 1,5333 - 0,54 3,6 - 0,525 3,5 Dari nilai sudut polarisasi observasi maka dapat diperoleh nilai sudut polarisasi sampel yang diamati yaitu : Keterangan : = besarnya sudut putar bidang polarisasi cahaya untuk standar Universitas Sumatera Utara