BAB III METODE PENELITIAN
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental, meliputi pengumpulan tumbuhan, pembuatan simplisia, karakterisasi dan skrining
fitokimia simplisia, pembuatan ekstrak etanol daun sirsak, karakterisasi dan skrining fitokimia ekstrak, penyiapan hewan percobaan, perlakuan pada hewan percobaan,
pengukuran kadar kreatinin dan urea serum darah. Data hasil penelitian dianalisis dengan metode analisis variansi ANAVA dengan tingkat kepercayaan 95,
dilanjutkan dengan metode uji post hoc Duncan untuk melihat perbedaan nyata antar perlakuan menggunakan program SPSS Statistical Product and Service Solution
versi 17. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi, Laboratorium Farmakologi dan Laboratorium Farmasi Fisik Fakultas Farmasi Universitas Sumatera
Utara pada bulan Agustus 2013 sampai Desember 2013.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi blender Philip, lemari pengering, neraca listrik Mettler Toledo, neraca hewan GW-1500, rotary
evaporator Heidolph WB 2000, water bath, hotplate, tanur Nabertherm, vortex V1 plus Boeco Germany, alat sentrifugasi Dynamica, spektrofotometer UV-
Visible Shimadzu, spuit, oral sonde, mortar dan stamfer, dan alat-alat gelas lainnya.
3.2 Bahan-bahan
Bahan kimia yang digunakan adalah reagen kreatinin, reagen urea, etanol 96 teknis, pereaksi Bouchardat, Dragendorff, Mayer, besi III klorida 4,5 bv,
Universitas Sumatera Utara
Molish, timbal II asetat 0,4 M, asam sulfat 6 N, asam klorida 2 N, Lieberman- Burchard, toluena, kloroform, asam klorida, kloralhidrat, Na-CMC Natrium -
Carboxy Methyl Cellulose, gentamisin dan akuades teknis.
3.3 Prosedur Pembuatan Simplisia
3.3.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Bahan tumbuhan yang digunakan adalah daun sirsak Annona muricata L. yang segar. Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif tanpa
membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan tumbuhan diambil dari Kelurahan Simalingkar B, Kecamatan Medan Tuntungan, Kota Medan,
Provinsi Sumatera Utara
3.3.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani
Pusat Penelitian Biologi – LIPI Bogor. 3.3.3 Pembuatan simplisia
Bahan tumbuhan daun sirsak yang masih segar dikumpulkan, dicuci bersih di bawah air mengalir, ditiriskan dan ditimbang berat basahnya 3,289 kg. Daun sirsak
selanjutnya dikeringkan di lemari pengering hingga kering, dibuang benda-benda asing atau pengotoran-pengotoran lain yang masih tertinggal pada simplisia sortasi
kering, ditimbang berat keringnya 604 gram kemudian diserbuk dan disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat.
3.4 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia dan Ekstrak
Pemeriksaan karakteristik simplisia dan ekstrak meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut air,
Universitas Sumatera Utara
penetapan kadar sari larut etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu tidak larut dalam asam WHO, 1998; Ditjen POM, 1995.
3.4.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk dari daun sirsak segar dan simplisia daun sirsak.
3.4.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia daun sirsak. Daun sirsak dipotong melintang lalu diletakkan di atas kaca objek yang telah ditetesi
dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop.
3.4.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung, tabung
penerima 5 ml berskala 0,05 ml, alat penampung dan pemanas listrik. Cara kerja: Dimasukkan 200 ml toluen dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat,
lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toulen dibiarkan mendingin selama 30 menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml.
Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen
mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik.
Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan
mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air
Universitas Sumatera Utara
dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung
dalam persen WHO, 1998; Ditjen POM, 1995.
3.4.4 Penetapan kadar sari larut air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air- kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu bersumbat
sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap
bahan yang telah dikeringkan WHO, 1998; Ditjen POM, 1995
3.4.5 Penetapan kadar sari larut etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian
dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang
berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung
terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1998; Ditjen POM, 1995
3.4.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia dan ekstrak dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai
arang habis, jika arang masih tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas, saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring dalam krus yang
Universitas Sumatera Utara
sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1998; Ditjen
POM, 1995.
3.4.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu didihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan,
disaring melalui kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam
asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1998; Ditjen POM, 1995.
3.5 Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak
Skrining fitokimia serbuk simplisia dan ekstrak meliputi pemeriksaan senyawa golongan flavonoid, alkaloid, saponin, tannin, glikosida dan
steroidtriterpenoid.
3.5.1 Pemeriksaan flavonoid
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang 0,5 g, lalu ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas melalui
kertas saring. Filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling, setelah dingin ditambahkan 5 ml petroleum eter, dikocok hati-hati, lalu didiamkan sebentar.
Lapisan metanol diambil, diuapkan pada temperatur 40°C, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etilasetat, disaring. Filtratnya digunakan untuk uji flavonoid dengan cara
berikut:
Universitas Sumatera Utara
a. sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol
96, lalu ditambah 0,5 g serbuk Zn dan 2 ml asam klorida 2 N. Didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida pekat. Jika dalam
waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoid glikosida-3-flavonol.
b. sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 1-2 ml etanol 96, lalu ditambah 0,1 g serbuk Mg dan 10 tetes asam klorida pekat. Jika terjadi
warna merah jingga sampai warna merah ungu menunjukkan adanya flavonoid. Jika terjadi warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon dan auron
Ditjen POM, 1995.
3.5.2 Pemeriksaan alkaloid
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas
penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk tes alkaloid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 ml
filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi: a.
ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer b.
ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c.
ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari tiga percobaan di
atas Ditjen POM, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.5.3 Pemeriksaan saponin
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan,
kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Jika terbentuk busa setinggi 1 - 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan buih tidak hilang dengan penambahan 1
tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Ditjen POM, 1995.
3.5.4 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dan ekstrak disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil
2 ml larutan dan ditambahkan 1 - 2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Ditjen POM,
1995.
3.5.5 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 96-air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N,
direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5
menit, lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran kloroform - isopropanol 3:2 sebanyak 3 kali. Pada kumpulan sari lapisan isopropanol diuapkan pada suhu
tidak lebih dari 50°C. Sisanya dilarutkan dengan 2 ml metanol untuk larutan percobaan, 0,1 ml larutan percobaan diuapkan di atas penangas air, pada sisa
ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes Molish, kemudian ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat, terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan, menunjukkan adanya
ikatan gula Ditjen POM, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.5.6 Pemeriksaan steroidtriterpenoid
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang sebanyak 1 g, dimaserasi dengan 20 ml n-heksana selama 2 jam, disaring. Filtrat diuapkan dalam
cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard melalui dinding cawan. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah
menjadi biru ungu atau biru hijau menunjukkan adanya steroidtriterpenoid Harborne, 1987.
3.6 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Sirsak
Sebanyak 200 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam wadah kaca, ditambahkan dengan etanol 96 sebanyak 1,5 L, tutup, biarkan selama 5 hari
terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, serkai, peras, cuci ampas dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 2 L. Pindahkan ke dalam bejana tertutup,
biarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari. Dienap tuangkan atau saring. Hasil yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator lalu di freeze
drying untuk menghilangkan kandungan pelarutnya Ditjen POM, 1979.
3.7 Pembuatan Pereaksi
Pembuatan pereaksi mencakup pembuatan Na-CMC 0,5 dan pembuatan suspensi Ekstrak Etanol Daun Sirsak EEDS 8.
3.7.1 Pembuatan Na-CMC 0,5
Sebanyak 0,5 g Na-CMC ditaburkan dalam lumpang yang berisi ±20 ml air suling panas. Didiamkan selama 15 menit lalu digerus hingga diperoleh massa yang
transparan, lalu digerus sampai homogen, diencerkan dengan air suling,
Universitas Sumatera Utara
dihomogenkan dan dimasukkan ke labu tentukur 100 ml, dicukupkan volumenya dengan air suling hingga 100 ml.
3.7.2 Pembuatan suspensi ekstrak etanol daun sirsak EEDS 8
Sebanyak 2 g ekstrak etanol daun sirsak dimasukkan ke dalam lumpang dan ditambahkan Na-CMC 0,5 bv sedikit demi sedikit sambil digerus sampai homogen
hingga 25 ml.
3.8 Penyiapan Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah tikus putih jantan galur Wistar dengan berat badan 180 - 200 g. Sebelum perlakuan, hewan percobaan
dikondisikan terlebih dahulu selama 1 minggu dengan kondisi lingkungan, makanan, suhu dan minuman yang sama. Setelah 1 minggu, dipilih tikus yang sehat ditandai
dengan berat badan yang stabil atau meningkat.
3.9 Perlakuan Hewan Percobaan
Tikus jantan galur Wistar sebanyak 20 ekor dengan berat badan 180 - 200 g ditimbang berat badannya, dikelompokkan secara acak menjadi 5 kelompok,
sehingga setiap kelompok terdiri dari 4 ekor tikus dan diberi perlakuan sebagai berikut:
Kelompok I : Tikus diberikan 0,5 CMC-Na dosis 1 bb secara oral.
Kelompok II : Tikus diberikan 0,5 CMC-Na dosis 1 bb secara oral dan gentamisin 40 mgml dosis 100 mgkg bb secara intraperitonial.
Universitas Sumatera Utara
Kelompok III : Tikus diberikan suspensi EEDS dosis 100 mgkg bb secara oral dan 60 menit kemudian tikus diberikan gentamisin 40 mgml dosis 100
mgkg bb secara intraperitonial. Kelompok IV : Tikus diberikan suspensi EEDS dosis 200 mgkg bb secara oral dan
60 menit kemudian tikus diberikan gentamisin 40 mgml dosis 100 mgkg bb secara intraperitonial.
Kelompok V : Tikus diberikan suspensi EEDS dosis 300 mgkg bb secara oral dan 60 menit kemudian tikus diberikan gentamisin 40 mgml dosis 100
mgkg bb secara intraperitonial. Seluruh perlakuan dilakukan selama 8 hari dan semua hewan percobaan dibunuh
pada hari kedelapan dengan cara dibius dengan kloroform, kemudian diambil cuplikan darah melalui jantung tikus Kore, et al., 2011; Chatterjee, et al., 2012.
3.10 Penyiapan Serum Darah Tikus
