d. Pembuatan larutan stok rutin Sebanyak 2,5 mg stok rutin ditimbang dan ditambahkan metanol p.a
hingga 10 ml. e. Pembuatan larutan seri
Diambil 0,5; 1,0; 1,5; 2, dan 2,5 larutan stok rutin dan diencerkan dengan metanol p.a hingga 25 ml pada labu ukur, sehingga akan diperoleh larutan dengan
konsentrasi 5; 10; 15; 20; 25 μ gml. f.
Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan dari ekstrak beras hitam Sebanyak 25 mg ekstrak ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a
sampai 25 ml dan didapatkan konsentrasi 1 mg ml. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 0,5; 1; 1,5; 2 dan 2,5 ml lalu ditambahkan dengan metanol p.a hingga 10
ml, sehingga didapat konsentrasi 50; 100; 150; 200; 250 μ gml.
6. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik Sejumlah 0,5 ml larutan uji 950 μ gml dan larutan pembanding asam galat
120 μ gml dimasukkan masing-masing dalam tabung reaksi dan ditambahkan 2,5 ml larutan reagen Folin-Ciocalteu yang diencerkan dengan aquadest 110 vv.
Larutan tersebut kemudian ditambahkan dengan 7,5 ml natrium bikarbonat 1M. Setelah 10 menit warna larutan diamati.
b. Uji pendahuluan aktvitas antioksidan Sebanyak 1 ml larutan DPPH dimasukkan dalam masing-masing 3 tabung
reaksi. Pada masing-masing tabung reaksi kemudian ditambahakan dengan 1 ml metanol p.a sebagai kontrol, larutan pembanding rutin konsentrasi 15 µgml, dan
larutan uji konsentrasi 150 µgml. Selanjutnya, diencerkan dengan 3 ml metanol p.a. Larutan tersebut divortex 30 detik. Setelah 30 menit diamati perubahan warna yang
terjadi.
7. Optimasi metode penentuan kandungan fenolik total
a. Penentuan operating time OT Dibuat larutan baku asam galat konsentrasi 40; 80; dan 120 µgml dan
masing-masing larutan diambil 0,5 ml dan ditambahkan dengan 5 ml reagen Folin- Ciocalteu yang diencerkan dengan aquadest 1:1.
Kemudian larutan tersebut ditambahakan dengan 4 ml larutan natrium bikarbonat 1 M. Absorbansinya diukur
pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Pengerjaan dilakukan tiga kali replikasi. Operating time tercapai ketika absorbansi larutan telah stabil.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum Dibuat larutan baku asam galat dengan konsentrasi 40; 80; dan 120 µgml
dan masing-masing diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambahkan dengan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1:1 kemudian larutan
ditambahkan 4 ml larutan natrium karbonat 1M. Didiamkan selama OT kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 600-800 nm.
8. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 40; 60; 80; 100; dan 120 µgml
ditambahkan dengan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air
1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 ml natrium bikarbonat 1M. larutan didiamkan selama OT, absorbansinya diukur pada panjang gelombang
maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a. 1:1, reagen Folin-Ciocalteu, dan larutan natrium bikarbonat 1M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.
b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total Hasil dari prosedur 10 a divalidasi berdasarkan parameter presisi RSD,
linearitas nilai r serta spesifisitas spektra kontrol. c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 ml larutan uji 950 µgml, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam
galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat mg ekivalen asam galat per gram fraksi air. Dilakukan tiga kali replikasi.
9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
