BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan termasuk observasional dan eksperimental dengan rancangan acak sederhana.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi air ekstrak etanolik beras hitam. 2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak etanolik beras
hitam untuk menangkap radikal DPPH IC. 3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh, waktu pemanenan, dan
cara panen beras hitam. 4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa cahaya matahari, cuaca, komposisi
senyawa dalam ekstrak, dan curah hujan.
C. Definisi Operasional
1. Ekstrak etanolik beras hitam adalah sari hasil proses maserasi beras hitam dengan penyari etanol 70 yang kemudian diuapkan dengan vacuum rotary
evaporator .
2. Fraksi air adalah hasil dari ekstrak etanolik yang dilarutkan dengan air hangat, kemudian difraksinasi dengan menggunakan wasbensin. Fraksi air yang
didapatkan kemudian difraksinasi lebih lanjut menggunakan etil asetat, kemudian diambil fraksi airnya dan diuapkan dengan vacuum rotary evaporator.
3. Persen inhibition concentration IC adalah persen yang menyatakan kemampuan fraksi air ekstrak etanolik beras hitam untuk menangkap radikal
DPPH. 4. Inhibition concentration 50 IC
50
adalah nilai konsentrasi dari fraksi air ekstrak etanolik beras hitam yang dapat menghasilkan penangkapan sebesar 50
radikal DPPH.
D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah beras hitam Oryza sativa L. subsp. indica yang diperoleh di daerah Ledokwareng, Sardonoharjo, Ngaglik,
Sleman, Yogyakarta. akuades Laboratorium Farmasi Fisika Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma; bahan kualitas pro analitik E. Merck meliputi:
metanol, bahan kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA, yaitu: DPPH 1,1- difenil-2 pikrilhidrazil, reagen Folin-Ciocalteu dan rutin, asam galat; bahan
kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu wasbensin dan etil asetat; bahan kualitas teknis CV. General Labora, yaitu aluminium foil.
2. Alat penelitian
Blender , neraca analitik Scaltec SBC 22, BP 160P, vacuum rotary
evaporator Janke Kunkel, waterbath labo-tech, Heraeus, vortex Janke
Kunkel, spektrofotometer UV-Vis Perkin Elmer Lamda 20, corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000 µl; 1-10 ml Acura 825, Socorex, tabung reaksi bertutup,
dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis Pyrex-Germany dan Iwaki.
E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi beras hitam
Determinasi beras hitam dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi USD menurut USDA 2012.
2. Pengumpulan bahan
Beras hitam diperoleh dari hasil pertanian di daerah Ledokwareng Sardonoharjo, Ngaglik, Sleman. Pengambilan beras hitam dengan kriteria berwarna
hitam segar dan pada saat usia sekitar 4-5 bulan.
3. Preparasi sampel
Sebanyak 100 g beras hitam segar, dibersihkan, lalu dikeringkan anginkan pada suhu ruangan. Kemudian beras dihaluskan dengan blender. Beras yang telah
dihaluskan dituang ke dalam bejana maserasi, ditambah cairan penyari etanol sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen.
Campuran dimaserasi selama lima hari pada suhu ruangan. Filtrat diperoleh melalui penyaringan menggunakan kertas saring dengan bantuan corong
Buchner dan pompa vakum. Ampas penyaringan diremaserasi dengan etanol secukupnya selama lima hari. Kemudian filtratnya dicampurkan dengan filtrat
terdahulu. Keseluruhan filtrat yang diperoleh diuapkan pelarutnya hingga diperoleh ekstrak etanolik beras hitam.
4. Pembuatan fraksi air
Ekstrak etanolik beras hitam ditambah 300 ml air hangat dan dilakukan ekstraksi cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan ekstrak :
wasbensin 1:1 vv, kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Fase air akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase wasbensin berada pada bagian atas.
Dari hasil ekstraksi cair-cair tersebut diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi air. Selanjutnya, fraksi air diekstraksi lagi menggunakan etil
asetat dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat 1:1 vv, sehingga didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi air diuapkan dengan
vacuum rotary evaporator . Lalu fraksi yang telah kering digunakan untuk analisis
lebih lanjut.
5. Pembuatan larutan DPPH, pembanding, dan uji
a. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total Sebanyak 9,5 mg fraksi air ditimbang, kemudian diencerkan dengan metanol
p.a sampai 10 ml, sehingga didapatkan konsentrasi sebesar 950 μ gml. b. Pembuatan larutan asam galat
Sebanyak 25 mg asam galat ditimbang dan diencerkan dengan metanol p.a : aquadest 1:1 sampai 50 ml sehinggga didapatkan konsentrasi 500 μ gml. Diambil
sebanyak 2; 3; 4; 5; 6 ml larutan tersebut kemudian diencerkan dengan metanol p.a : aquadest 1:1 hingga 25 ml kemudian akan diperoleh larutan asam galat dengan
konsentrasi 40; 60; 80; 100; 120 μ gml. c. Pembuatan larutan DPPH
Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a, sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan
aluminium foil dan dibuat selalu baru.
d. Pembuatan larutan stok rutin Sebanyak 2,5 mg stok rutin ditimbang dan ditambahkan metanol p.a
hingga 10 ml. e. Pembuatan larutan seri
Diambil 0,5; 1,0; 1,5; 2, dan 2,5 larutan stok rutin dan diencerkan dengan metanol p.a hingga 25 ml pada labu ukur, sehingga akan diperoleh larutan dengan
konsentrasi 5; 10; 15; 20; 25 μ gml. f.
Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan dari ekstrak beras hitam Sebanyak 25 mg ekstrak ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a
sampai 25 ml dan didapatkan konsentrasi 1 mg ml. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 0,5; 1; 1,5; 2 dan 2,5 ml lalu ditambahkan dengan metanol p.a hingga 10
ml, sehingga didapat konsentrasi 50; 100; 150; 200; 250 μ gml.
6. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik Sejumlah 0,5 ml larutan uji 950 μ gml dan larutan pembanding asam galat
120 μ gml dimasukkan masing-masing dalam tabung reaksi dan ditambahkan 2,5 ml larutan reagen Folin-Ciocalteu yang diencerkan dengan aquadest 110 vv.
Larutan tersebut kemudian ditambahkan dengan 7,5 ml natrium bikarbonat 1M. Setelah 10 menit warna larutan diamati.
b. Uji pendahuluan aktvitas antioksidan Sebanyak 1 ml larutan DPPH dimasukkan dalam masing-masing 3 tabung
reaksi. Pada masing-masing tabung reaksi kemudian ditambahakan dengan 1 ml metanol p.a sebagai kontrol, larutan pembanding rutin konsentrasi 15 µgml, dan
larutan uji konsentrasi 150 µgml. Selanjutnya, diencerkan dengan 3 ml metanol p.a. Larutan tersebut divortex 30 detik. Setelah 30 menit diamati perubahan warna yang
terjadi.
7. Optimasi metode penentuan kandungan fenolik total
a. Penentuan operating time OT Dibuat larutan baku asam galat konsentrasi 40; 80; dan 120 µgml dan
masing-masing larutan diambil 0,5 ml dan ditambahkan dengan 5 ml reagen Folin- Ciocalteu yang diencerkan dengan aquadest 1:1.
Kemudian larutan tersebut ditambahakan dengan 4 ml larutan natrium bikarbonat 1 M. Absorbansinya diukur
pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Pengerjaan dilakukan tiga kali replikasi. Operating time tercapai ketika absorbansi larutan telah stabil.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum Dibuat larutan baku asam galat dengan konsentrasi 40; 80; dan 120 µgml
dan masing-masing diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambahkan dengan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1:1 kemudian larutan
ditambahkan 4 ml larutan natrium karbonat 1M. Didiamkan selama OT kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 600-800 nm.
8. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 40; 60; 80; 100; dan 120 µgml
ditambahkan dengan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air
1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 ml natrium bikarbonat 1M. larutan didiamkan selama OT, absorbansinya diukur pada panjang gelombang
maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a. 1:1, reagen Folin-Ciocalteu, dan larutan natrium bikarbonat 1M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.
b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total Hasil dari prosedur 10 a divalidasi berdasarkan parameter presisi RSD,
linearitas nilai r serta spesifisitas spektra kontrol. c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 ml larutan uji 950 µgml, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam
galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat mg ekivalen asam galat per gram fraksi air. Dilakukan tiga kali replikasi.
9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan panjang gelombang maksimum Pada tiga labu ukur 10 ml, dimasukkan masing- masing 0,4; 1,2; dan 2 ml
larutan DPPH 0,4 mM. Tiap labu ukur tersebut ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas, sehingga didapatkan konsentrasi DPPH sebesar 0,016; 0,048; dan
0,080 mM. Larutan tersebut divortex 30 detik. Larutan kemudian didiamkan selama 30 menit. Lalu dilakukan pengukuran absorbansinya dengan spektrofotometer
visible pada panjang gelombang antara 400-600 nm.
b. Penentuan operating time OT Sejumlah larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam labu ukur sebanyak tiga
buah berukuran 5 ml. Kemudian masing-masing labu ukur ditambahkan dengan 1 ml larutan pembanding rutin 5; 15; dan 25 µgml kemudian ditambahkan metanol
p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut divortex selama 30 detik. Setelah itu diukur absorbansinya dengan spektrofotometri visible pada panjang gelombang hasil
pengukuran selama 1 jam .
Perlakuan ini juga dilakukan untuk mencari OT dari larutan uji fraksi air pada konsentrasi 50, 150, dan 250 µgml.
10. Pengujian aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol Pada labu takar 5,0 ml, dimasukkan sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4
mM kemudian ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut diukur absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang serapan maksimum.
Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan kontrol untuk menguji larutan pembanding dan larutan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji Sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam masing-
masing labu ukur 5,0 ml kemudian ditambah dengan 1,0 ml larutan pembanding 5; 10; 15; 20; 25 μ gml dan larutan uji 50; 100; 150; 200; 250 μ gml. Selanjutnya,
tambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan diukur absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali.
c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan Hasil dari prosedur 7 a dan b divalidasi berdasarkan parameter presisi
RSD, linearitas nilai r serta spesifisitas spektra kontrol. d. Prosedur 8 a dan b kemudian dihitung IC dan IC
50
untuk rutin dan fraksi air ekstrak etanolik beras hitam.
F. Analisis Hasil
Kandungan fenolik total dalam fraksi air ekstrak etanolik beras hitam dihitung sebagai massa ekivalen asam galat per gram fraksi air ekstrak etanolik
beras hitam. Nilai absorbansi larutan uji dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku asam galat, sehingga diperoleh nilai ekivalensi larutan uji terhadap asam galat.
Kemudian dilakukan perhitungan lebih lanjut berdasarkan rumus di bawah. Kandungan fenolik total
=
Aktivitas penangkapan radikal DPPH IC dihitung dengan rumus : IC =
100 Data aktivitas dianalisis dan dihitung nilai IC
50
melalui persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun larutan
pembanding dan y adalah IC. Untuk menentukan ada atau tidaknya perbedaan
bermakna antara IC
50
antara larutan pembanding dan larutan uji kemudian dilakukan analisis statistik.
Skema
Determinasi beras hitam
Pengumpulan bahan
Pembuatan ekstrak etanolik beras hitam dengan etanol 70
Gambar 2. Skema jalannya penelitian
Fraksi air
Ekstraksi cair-cair dengan etil asetat
Fraksi air diuapkan dengan vacuum rotary evaporator Fraksi etil asetat
Uji pendahuluan senyawa fenolik Optimasi uji aktivitas antioksidan
Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
Validasi metode uji aktivitas antioksidan Validasi metode penetapan
kandungan fenolik total Estimasi aktivitas antioksidan
Estimasi kandungan fenolik total Analisis statistik dengan program R
Ekstraksi cair-cair dengan wasbensin Pelarut diuapkan dengan vacuum rotary evaporator
Fraksi wasbensin
Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi Beras Hitam
Langkah awal untuk melakukan suatu penelitian adalah dengan melakukan determinasi. Determinasi bertujuan untuk memastikan kebenaran identitas beras
yang akan digunakan dalam penelitian, sehingga dapat menghindari kemungkinan kesalahan dalam pengambilan sampel beras hitam. Determinasi beras hitam
dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tanggal 14 Mei 2013 berdasarkan acuan dari USDA 2012.
Hasil determinasi menunjukkan bahwa memang benar beras yang digunakan adalah Oryza sativa L.. Hasil determinasi juga dikuatkan dengan adanya surat
determinasi beras 1 lampiran yang disetujui oleh Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
B. Hasil Pengumpulan Bahan
Beras yang digunakan diperoleh langsung dari distributor beras hitam di daerah Ledokwareng, Sardonoharjo, Ngaglik, Sleman, Yogyakarta pada tanggal 26
Januari 2013. Beras hitam yang digunakan dalam penelitian ini merupakan beras hitam budidaya yang ditanam melalui pertanian secara organik dan dikonsumsi oleh
masyarakat setempat. Beras hitam yang baik memiliki kriteria sebagai berikut yaitu, dipanen saat musim kemarau dan dengan umur beras hitam berkisaran antara 4-5
Kategori