6
Organ dan darah dihomogenkan dan dibuat pengenceran serial 10 kali dengan larutan PBS steril. Kemudian dilakukan pengenceran serial sampai
dengan 10
-8
. Prosedur kerjanya yaitu eppendorf diisi dengan 0,9 ml PBS. Setelah itu, suspensi bakteri diambil 0,1 ml dari larutan stok kemudian dimasukkan ke
dalam eppendorf 10
-1
, divortex, berikutnya diambil 0,1 ml dimasukkan dalam eppendorf yang berisi 0,9 ml PBS berlabel 10
-2
. Pengenceran tersebut dilakukan secara aseptis sampai dengan pengenceran 10
-8
. Selanjutnya suspensi bakteri hasil dari setiap pengenceran diambil 25
m lalu dikultur pada media agar padat dengan cara disebar pada media BHIA dilakukan duplo. Setelah diinkubasi pada
suhu 37
o
C selama 24 jam, koloni bakteri S. agalactiae yang tumbuh diamati dan dihitung secara TPC dengan metode cawan tuang. Populasi bakteri yang tumbuh
ditentukan dalam Colony Forming Unit CFUml dan dihitung dengan rumus Fardiaz 1993, sebagai berikut:
Dimana: PM = Populasi bakteri CFUml
K = Jumlah koloni
A = Volume inokulasi dalam media pengencer ml
B = Pada pengenceran keberapa koloni bakteri dihitung
2.4 Perubahan Makroskopis dan Mikroskopis Akibat Infeksi Bakteri S. agalactiae pada Ikan Nila
Perubahan makroskopis dan mikroskopis, parameter yang diamati meliputi: patologi anatomi organ internal secara makroskopis, berupa perubahan bentuk,
ukuran, konsistensi dan warna organ hati dan ginjal, sedangkan secara mikroskopis diamati tingkat kerusakan jaringan organ hati, otak, dan ginjal,
dengan menggunakan metode histopatologis. Prosedur kerja sama dengan uji LD
50
dan uji distribusi bakteri patogen di dalam tubuh ikan nila. Ikan yang digunakan berjumlah 24 ekor untuk setiap tipe
bakteri, 1 ekor dikorbankan dari setiap kelompok mulai dari hari ke- 0, 3, 6, 9, 12, dan 15, ikan dimatikan dan dilakukkan nekropsi. Organ hati, otak dan ginjal
dilakukan pengamatan patologi anatomi internal secara makroskopis, setelah selesai diambil untuk dibuat preparat histopatologi, kemudian diamati dengan
mikroskop.
7
Prosedur pembuatan preparat histopatologi melalui 4 tahapan, yaitu fiksasi atau pengawetan jaringan, perlakuan jaringan, pemotongan jaringan dan
pewarnaan jaringan. Sampel yang digunakan merupakan potongan organ tubuh ikan sebagai tahap permulaan pembuatan sediaan histopatologis yang difiksasi
dalam larutan fiksatif Bouin’s. Larutan Bouin’s dibuat dari campuran asam pikrat jenuh 21 g
ℓ, formaldehyde solution min. 37, dan acetic acid glacial 100, dengan perbandingan 15 : 5 : 1. Pada penelitian ini organ tubuh yang digunakan
untuk sediaan histopatologis adalah hati, otak, dan ginjal. Sampel organ kemudian direndam dalam larutan fiksatif Bouin’s selama 24 jam. Sebelumnya jaringan
dipotong dengan ukuran kira-kira 1 x 1 cm. Potongan organ selanjutnya dilakukan proses jaringan yang terdiri dari
beberapa tahap antara lain proses dehidrasi pengambilan cairan dalam seljaringan, clearing penjernihan, impregnasi penyusunan paraffin
selanjutnya jaringan siap dibuat blok melalui proses embedding Lampiran 5. Proses ini bertujuan untuk membuat sediaan dalam blok paraffin sebagai
penunjang yang sangat diperlukan dalam proses pemotongan. Paraffin cair mula- mula dituang ke dalam wadah cetakan sebagai dasar pembuatan blok. Sediaan
diambil dengan pinset dan diletakkan di paraffin cair mula-mula dituang ke dalam wadah cetakan sebagai dasar pembuatan blok. Sediaan diambil menggunakan
pinset dan diletakkan dalam blok tersebut, kemudian bahan embedding dituang hingga memenuhi cetakan dengan sediaan di dalamnya. Blok kemudian ditempel
pada holder atau blok kayu. Sediaan yang telah ditanam dalam blok paraffin siap untuk dipotong dengan
menggunakan mikrotom setebal 5 µm dan dibuat preparat. Pemotongan diusahakan agar sambung menyambung berbentuk pita. Selanjutnya potongan pita
diapungkan dalam air suam kuku hangat kuku, agar jaringan dalam paraffin teregang. Objek glass yang bersih sebelumnya direndam dahulu dalam methanol.
Jaringan diangkat dari air dengan objek glass dan selanjutnya dikeringkan dengan suhu 40
o
C selama 24 jam lalu jaringan diwarnai. Proses pewarnaan jaringan dilakukan dengan cara memasukkan
preparatsediaan ke dalam larutan pewarna hemaktosilin selama 3-5 menit, dicuci dalam air mengalir, dilanjutkan dengan pencelupan ke dalam larutan pewarna
8
eosin selama 3 menit. Untuk menghilangkan kelebihan warna maka preparat dicuci dalam air mengalir selama 5 menit. Selanjutnya dilakukkan pencelupan ke
dalam alkohol 50, 70, 85, 90, alkohol absolut I dan alkohol absolut II masing-masing selama 2-3 menit. Dilanjutkan dengan pencelupan ke dalam
larutan xylol I dan II masing-masing selama 2-3 menit. Kemudian preparat jaringan, ditutup dengan cover glass yang sudah ditetesi dengan entellan neu,
dikeringkan pada suhu 40
o
C selama 24 jam, berikutnya dapat diamati di bawah mikroskop Lampiran 6.
2.5 Analisis Data
