Persiapan Ikan Uji Distribusi Bakteri S. agalactiae di dalam Tubuh Ikan Nila

3

II. METODE PENELITIAN

2.1 Persiapan Ikan Uji

Ikan nila Oreochromis niloticus BEST didatangkan dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Bogor yang berukuran rata-rata 5±0,2g, dipelihara selama ± 40 hari sampai mencapai ukuran rata-rata 15±0,3g di dalam bak semen berdimensi 3x2x0,8 m 3 . Ikan diberi makan dengan pakan komersial FF 999 yang mengandung 38 protein, diberikan setiap 3 kali sehari sebanyak 3-5 dari bobot tubuh. Sebelum memulai penelitian, 3 ikan dipilih secara acak untuk dilakukan nekropsi Giordano et al. 2010 Lampiran 1. Ginjal dan otak diambil untuk pemeriksaan bakteriologis, bertujuan verifikasi bahwa ikan nila yang digunakan tidak mengandung bakteri Streptococcus agalactiae.

2.2 Pengujian Kerentanan Ikan Nila Terhadap Infeksi Bakteri S. agalactiae

Pengujian kerentanan ikan nila terhadap bakteri S. agalactiae tipe hemolitik dan non-hemolitik dilakukan dengan menggunakan metode uji LD 50 . Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui jumlah bakteri yang dapat menyebabkan kematian ikan nila sebanyak 50 dari populasi dalam waktu 14-15 hari setelah penginfeksian. Adapun tahapan kegiatan yang dilakukan pada uji LD 50 ini, antara lain:

2.2.1 Identifikasi Bakteri Uji

Isolat bakteri S. agalactiae tipe β-hemolitik dan non-hemolitik diperoleh dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Bogor. Bakteri ini terlebih dahulu diamati morfologi koloni, karakteristik biokimia dan sifat Gram Lampiran 3. Hal ini bertujuan untuk memastikan bahwa isolat tersebut merupakan spesies bakteri yang diperlukan untuk kegiatan penelitian.

2.2.2 Penyediaan Bakteri Uji

Isolat stok Streptococcus agalactiae pada BHIA di agar miring disegarkan atau dimudakan fasase dengan mengkultur isolat pada media agar miring yang dilakukan sebanyak 2 kali. Penyiapan inokulum bakteri S. agalactiae dengan cara dilakukan pengkulturan kedalam media cair BHIB. Satu ose penuh biakan bakteri dari agar miring padat dikultur dalam 10 ml medium BHIB, diinkubasi dalam inkubator bergoyang water bath shaker pada 150 rpm, suhu 29-30 C 4 selama 24 jam. Kemudian biakan diambil dari media yang telah dikultur selama 24 jam sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam 9 ml medium BHIB, diinkubasi dalam inkubator bergoyang water bath shaker pada 150 rpm, suhu 29-30 C selama 24 jam. Setelah itu bakteri siap dipanen.

2.2.3 Peningkatan Virulensi Bakteri Uji

Kegiatan ini bertujuan untuk memperoleh bakteri yang paling patogen terhadap ikan nila sehingga siap digunakan untuk uji tantang yang dilakukan sesuai dengan prosedur postulat Koch. Ikan uji pada postulat Koch dimasukkan ke dalam 3 akuarium, antara lain: 2 akuarium untuk 2 tipe bakteri yang berbeda tipe β-hemolitik dan non-hemolitik dan 1 akuarium untuk kontrol diinjeksi dengan BHIB dengan padat tebar ikan uji 5 ekor per akuarium. Suspensi 2 tipe bakteri patogen masing-masing diinjeksi pada ikan uji. Ikan diamati setiap hari sampai menunjukkan gejala klinis dan kematian. Kemudian ikan diisolasi untuk diambil satu ose dari organ ginjal, mata dan otak. Diinokulasikan dengan metode penggoresan pada media BHIA. Koloni yang tumbuh, diamati morfologi koloni, karakteristik biokimia dan sifat Gram, untuk memastikan bakteri tersebut adalah spesies bakteri patogen yang diinfeksikan pada postulat Koch. Kemudian bakteri tersebut digores di atas agar miring dan dilakukan kultur cair seperti yang dilakukan diatas untuk postulat Koch kembali yang dilakukan sebanyak 2 kali.

2.2.4 Uji LD

50 Uji LD 50 bertujuan untuk mengetahui tingkat kepadatan bakteri yang menyebabkan kematian sebanyak 50 populasi ikan nila dalam waktu 14-15 hari setelah penginfeksian. Hasil uji LD 50 selanjutnya akan digunakan pada pengujian distribusi bakteri di dalam tubuh, serta pengujian perubahan makroskopis dan mikroskopis akibat infeksi bakteri patogen. Ikan nila yang berukuran rata-rata 15±0,3g dimasukkan ke dalam akuarium yang berdimensi 60x30x30 cm 3 yang berisi air 30 L sebanyak 10 ekor ikan per akuarium dengan 3 ulangan setiap dosis, sebelumnya diadaptasikan ± 3 hari di dalam akuarium. Pengujian dilakukan dengan 6 perlakuan dosis kepadatan menggunakan dosis 10 3 hingga 10 8 CFUml untuk tipe β-hemolitik dan 10 3 hingga 10 8 CFUml untuk tipe non-hemolitik. Setelah itu dilakukkan injeksi dengan volume injeksi 0,1 mlekor secara 5 intramuskular. Menurut Sukenda 2000, ikan uji dengan berat 100 g menerima 1 ml suspensi bakteri dari 3 x 10 3 – 3 x 10 6 CFUml sebagai standar dari injeksi bakteri. Perubahan yang terjadi diamati serta dicatat selama 14 hari. Parameter perubahan yang diamati meliputi perubahan tingkah laku ikan yang dapat dijadikan sebagai indikator kesehatan ikan, berupa tingkah laku renang, gejala klinis anatomi tubuh eksternal, berupa morfologi tubuh, kecerahan warna tubuh dan mata, pendarahan pada tubuh, dan penjernihan operkulum. Mortalitas dicatat dan dihitung menggunakan rumus Effendi 2002, sebagai berikut: sementara dosis hasil dari LD 50 dihitung dengan rumus Reed Muench 1938, sebagai berikut: Keterangan: A = Kematian diatas 50; B = Kematian dibawah 50 Log negatif LD 50 = Log negatif konsentrasi diatas 50 + Selang Proporsi

2.3 Distribusi Bakteri S. agalactiae di dalam Tubuh Ikan Nila

Pengujian ini bertujuan untuk mengamati distribusi dan jumlah koloni bakteri uji yang terdapat di hati, otak, ginjal, dan darah ikan nila. Infeksi dilakukan setelah diperoleh dosis LD 50 dari pengujian kerentanan ikan nila terhadap infeksi bakteri S. agalactiae tipe hemolitik dan non-hemolitik. Metode penginfeksian digunakan dosis LD 50 . Sebanyak 18 ekor ikan untuk setiap perlakuan bakteri S. agalactiae tipe β-hemolitik dan tipe non-hemolitik. Prosedur kerja sama dengan uji LD 50 . Setelah inokulasi bakteri, 1 ekor ikan dikorbankan dari setiap kelompok mulai dari hari ke 0, 3, 6, 9, 12, dan 15. Kemudian ikan diambil darahnya dari pembuluh darah caudal dengan menggunakan syringe 1 ml. Ikan nila kemudian dimatikan, diambil secara aseptis sampel dari organ hati, otak dan ginjal. Jaringan dan darah dibuat dengan menghomogenisasi sampel organ dalam larutan PBS steril. Masing-masing organ ditimbang sebanyak 0,1 g, selanjutnya organ tersebut dimasukkan ke dalam eppendorf lalu digerus dan ditambakan PBS 0,9 ml. 6 Organ dan darah dihomogenkan dan dibuat pengenceran serial 10 kali dengan larutan PBS steril. Kemudian dilakukan pengenceran serial sampai dengan 10 -8 . Prosedur kerjanya yaitu eppendorf diisi dengan 0,9 ml PBS. Setelah itu, suspensi bakteri diambil 0,1 ml dari larutan stok kemudian dimasukkan ke dalam eppendorf 10 -1 , divortex, berikutnya diambil 0,1 ml dimasukkan dalam eppendorf yang berisi 0,9 ml PBS berlabel 10 -2 . Pengenceran tersebut dilakukan secara aseptis sampai dengan pengenceran 10 -8 . Selanjutnya suspensi bakteri hasil dari setiap pengenceran diambil 25 m lalu dikultur pada media agar padat dengan cara disebar pada media BHIA dilakukan duplo. Setelah diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam, koloni bakteri S. agalactiae yang tumbuh diamati dan dihitung secara TPC dengan metode cawan tuang. Populasi bakteri yang tumbuh ditentukan dalam Colony Forming Unit CFUml dan dihitung dengan rumus Fardiaz 1993, sebagai berikut: Dimana: PM = Populasi bakteri CFUml K = Jumlah koloni A = Volume inokulasi dalam media pengencer ml B = Pada pengenceran keberapa koloni bakteri dihitung

2.4 Perubahan Makroskopis dan Mikroskopis Akibat Infeksi Bakteri S. agalactiae pada Ikan Nila