3
II. METODE PENELITIAN
2.1 Persiapan Ikan Uji
Ikan nila Oreochromis niloticus BEST didatangkan dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Bogor yang berukuran rata-rata 5±0,2g, dipelihara
selama ± 40 hari sampai mencapai ukuran rata-rata 15±0,3g di dalam bak semen berdimensi 3x2x0,8 m
3
. Ikan diberi makan dengan pakan komersial FF 999 yang mengandung 38 protein, diberikan setiap 3 kali sehari sebanyak 3-5 dari bobot
tubuh. Sebelum memulai penelitian, 3 ikan dipilih secara acak untuk dilakukan nekropsi Giordano et al. 2010 Lampiran 1. Ginjal dan otak diambil untuk
pemeriksaan bakteriologis, bertujuan verifikasi bahwa ikan nila yang digunakan tidak mengandung bakteri Streptococcus agalactiae.
2.2 Pengujian Kerentanan Ikan Nila Terhadap Infeksi Bakteri S. agalactiae
Pengujian kerentanan ikan nila terhadap bakteri S. agalactiae tipe hemolitik dan non-hemolitik dilakukan dengan menggunakan metode uji LD
50
. Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui jumlah bakteri yang dapat menyebabkan kematian
ikan nila sebanyak 50 dari populasi dalam waktu 14-15 hari setelah penginfeksian. Adapun tahapan kegiatan yang dilakukan pada uji LD
50
ini, antara lain:
2.2.1 Identifikasi Bakteri Uji
Isolat bakteri
S. agalactiae tipe
β-hemolitik dan non-hemolitik diperoleh dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Bogor. Bakteri ini terlebih dahulu
diamati morfologi koloni, karakteristik biokimia dan sifat Gram Lampiran 3. Hal ini bertujuan untuk memastikan bahwa isolat tersebut merupakan spesies bakteri
yang diperlukan untuk kegiatan penelitian.
2.2.2 Penyediaan Bakteri Uji
Isolat stok
Streptococcus agalactiae pada BHIA di agar miring disegarkan
atau dimudakan fasase dengan mengkultur isolat pada media agar miring yang dilakukan sebanyak 2 kali. Penyiapan inokulum bakteri S. agalactiae dengan cara
dilakukan pengkulturan kedalam media cair BHIB. Satu ose penuh biakan bakteri dari agar miring padat dikultur dalam 10 ml medium BHIB, diinkubasi
dalam inkubator bergoyang water bath shaker pada 150 rpm, suhu 29-30 C
4
selama 24 jam. Kemudian biakan diambil dari media yang telah dikultur selama 24 jam sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam 9 ml medium BHIB, diinkubasi
dalam inkubator bergoyang water bath shaker pada 150 rpm, suhu 29-30 C
selama 24 jam. Setelah itu bakteri siap dipanen.
2.2.3 Peningkatan Virulensi Bakteri Uji
Kegiatan ini bertujuan untuk memperoleh bakteri yang paling patogen terhadap ikan nila sehingga siap digunakan untuk uji tantang yang dilakukan
sesuai dengan prosedur postulat Koch. Ikan uji pada postulat Koch dimasukkan ke dalam 3 akuarium, antara lain: 2
akuarium untuk 2 tipe bakteri yang berbeda tipe β-hemolitik dan non-hemolitik
dan 1 akuarium untuk kontrol diinjeksi dengan BHIB dengan padat tebar ikan uji 5 ekor per akuarium. Suspensi 2 tipe bakteri patogen masing-masing diinjeksi
pada ikan uji. Ikan diamati setiap hari sampai menunjukkan gejala klinis dan kematian. Kemudian ikan diisolasi untuk diambil satu ose dari organ ginjal, mata
dan otak. Diinokulasikan dengan metode penggoresan pada media BHIA. Koloni yang tumbuh, diamati morfologi koloni, karakteristik biokimia dan sifat Gram,
untuk memastikan bakteri tersebut adalah spesies bakteri patogen yang diinfeksikan pada postulat Koch. Kemudian bakteri tersebut digores di atas agar
miring dan dilakukan kultur cair seperti yang dilakukan diatas untuk postulat Koch kembali yang dilakukan sebanyak 2 kali.
2.2.4 Uji LD
50
Uji LD
50
bertujuan untuk mengetahui tingkat kepadatan bakteri yang menyebabkan kematian sebanyak 50 populasi ikan nila dalam waktu 14-15 hari
setelah penginfeksian. Hasil uji LD
50
selanjutnya akan digunakan pada pengujian distribusi bakteri di dalam tubuh, serta pengujian perubahan makroskopis dan
mikroskopis akibat infeksi bakteri patogen. Ikan nila yang berukuran rata-rata 15±0,3g dimasukkan ke dalam akuarium yang berdimensi 60x30x30 cm
3
yang berisi air 30 L sebanyak 10 ekor ikan per akuarium dengan 3 ulangan setiap dosis,
sebelumnya diadaptasikan ± 3 hari di dalam akuarium. Pengujian dilakukan dengan 6 perlakuan dosis kepadatan menggunakan dosis 10
3
hingga 10
8
CFUml untuk tipe
β-hemolitik dan 10
3
hingga 10
8
CFUml untuk tipe non-hemolitik. Setelah itu dilakukkan injeksi dengan volume injeksi 0,1 mlekor secara
5
intramuskular. Menurut Sukenda 2000, ikan uji dengan berat 100 g menerima 1 ml suspensi bakteri dari 3 x 10
3
– 3 x 10
6
CFUml sebagai standar dari injeksi bakteri. Perubahan yang terjadi diamati serta dicatat selama 14 hari.
Parameter perubahan yang diamati meliputi perubahan tingkah laku ikan yang dapat dijadikan sebagai indikator kesehatan ikan, berupa tingkah laku
renang, gejala klinis anatomi tubuh eksternal, berupa morfologi tubuh, kecerahan warna tubuh dan mata, pendarahan pada tubuh, dan penjernihan operkulum.
Mortalitas dicatat dan dihitung menggunakan rumus Effendi 2002, sebagai berikut:
sementara dosis hasil dari LD
50
dihitung dengan rumus Reed Muench 1938, sebagai berikut:
Keterangan: A = Kematian diatas 50; B = Kematian dibawah 50
Log negatif LD
50
= Log negatif konsentrasi diatas 50 + Selang Proporsi
2.3 Distribusi Bakteri S. agalactiae di dalam Tubuh Ikan Nila
Pengujian ini bertujuan untuk mengamati distribusi dan jumlah koloni bakteri uji yang terdapat di hati, otak, ginjal, dan darah ikan nila. Infeksi
dilakukan setelah diperoleh dosis LD
50
dari pengujian kerentanan ikan nila terhadap infeksi bakteri S. agalactiae tipe hemolitik dan non-hemolitik.
Metode penginfeksian digunakan dosis LD
50
. Sebanyak 18 ekor ikan untuk setiap perlakuan bakteri S. agalactiae tipe
β-hemolitik dan tipe non-hemolitik. Prosedur kerja sama dengan uji LD
50
. Setelah inokulasi bakteri, 1 ekor ikan dikorbankan dari setiap kelompok mulai dari hari ke 0, 3, 6, 9, 12, dan 15.
Kemudian ikan diambil darahnya dari pembuluh darah caudal dengan menggunakan syringe 1 ml. Ikan nila kemudian dimatikan, diambil secara
aseptis sampel dari organ hati, otak dan ginjal. Jaringan dan darah dibuat dengan menghomogenisasi sampel organ dalam larutan PBS steril. Masing-masing organ
ditimbang sebanyak 0,1 g, selanjutnya organ tersebut dimasukkan ke dalam eppendorf lalu digerus dan ditambakan PBS 0,9 ml.
6
Organ dan darah dihomogenkan dan dibuat pengenceran serial 10 kali dengan larutan PBS steril. Kemudian dilakukan pengenceran serial sampai
dengan 10
-8
. Prosedur kerjanya yaitu eppendorf diisi dengan 0,9 ml PBS. Setelah itu, suspensi bakteri diambil 0,1 ml dari larutan stok kemudian dimasukkan ke
dalam eppendorf 10
-1
, divortex, berikutnya diambil 0,1 ml dimasukkan dalam eppendorf yang berisi 0,9 ml PBS berlabel 10
-2
. Pengenceran tersebut dilakukan secara aseptis sampai dengan pengenceran 10
-8
. Selanjutnya suspensi bakteri hasil dari setiap pengenceran diambil 25
m lalu dikultur pada media agar padat dengan cara disebar pada media BHIA dilakukan duplo. Setelah diinkubasi pada
suhu 37
o
C selama 24 jam, koloni bakteri S. agalactiae yang tumbuh diamati dan dihitung secara TPC dengan metode cawan tuang. Populasi bakteri yang tumbuh
ditentukan dalam Colony Forming Unit CFUml dan dihitung dengan rumus Fardiaz 1993, sebagai berikut:
Dimana: PM = Populasi bakteri CFUml
K = Jumlah koloni
A = Volume inokulasi dalam media pengencer ml
B = Pada pengenceran keberapa koloni bakteri dihitung
2.4 Perubahan Makroskopis dan Mikroskopis Akibat Infeksi Bakteri S. agalactiae pada Ikan Nila