3
II. METODE PENELITIAN
2.1 Persiapan Ikan Uji
Ikan nila Oreochromis niloticus BEST didatangkan dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Bogor yang berukuran rata-rata 5±0,2g, dipelihara
selama ± 40 hari sampai mencapai ukuran rata-rata 15±0,3g di dalam bak semen berdimensi 3x2x0,8 m
3
. Ikan diberi makan dengan pakan komersial FF 999 yang mengandung 38 protein, diberikan setiap 3 kali sehari sebanyak 3-5 dari bobot
tubuh. Sebelum memulai penelitian, 3 ikan dipilih secara acak untuk dilakukan nekropsi Giordano et al. 2010 Lampiran 1. Ginjal dan otak diambil untuk
pemeriksaan bakteriologis, bertujuan verifikasi bahwa ikan nila yang digunakan tidak mengandung bakteri Streptococcus agalactiae.
2.2 Pengujian Kerentanan Ikan Nila Terhadap Infeksi Bakteri S. agalactiae
Pengujian kerentanan ikan nila terhadap bakteri S. agalactiae tipe hemolitik dan non-hemolitik dilakukan dengan menggunakan metode uji LD
50
. Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui jumlah bakteri yang dapat menyebabkan kematian
ikan nila sebanyak 50 dari populasi dalam waktu 14-15 hari setelah penginfeksian. Adapun tahapan kegiatan yang dilakukan pada uji LD
50
ini, antara lain:
2.2.1 Identifikasi Bakteri Uji
Isolat bakteri
S. agalactiae tipe
β-hemolitik dan non-hemolitik diperoleh dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Bogor. Bakteri ini terlebih dahulu
diamati morfologi koloni, karakteristik biokimia dan sifat Gram Lampiran 3. Hal ini bertujuan untuk memastikan bahwa isolat tersebut merupakan spesies bakteri
yang diperlukan untuk kegiatan penelitian.
2.2.2 Penyediaan Bakteri Uji
Isolat stok
Streptococcus agalactiae pada BHIA di agar miring disegarkan
atau dimudakan fasase dengan mengkultur isolat pada media agar miring yang dilakukan sebanyak 2 kali. Penyiapan inokulum bakteri S. agalactiae dengan cara
dilakukan pengkulturan kedalam media cair BHIB. Satu ose penuh biakan bakteri dari agar miring padat dikultur dalam 10 ml medium BHIB, diinkubasi
dalam inkubator bergoyang water bath shaker pada 150 rpm, suhu 29-30 C
4
selama 24 jam. Kemudian biakan diambil dari media yang telah dikultur selama 24 jam sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam 9 ml medium BHIB, diinkubasi
dalam inkubator bergoyang water bath shaker pada 150 rpm, suhu 29-30 C
selama 24 jam. Setelah itu bakteri siap dipanen.
2.2.3 Peningkatan Virulensi Bakteri Uji
Kegiatan ini bertujuan untuk memperoleh bakteri yang paling patogen terhadap ikan nila sehingga siap digunakan untuk uji tantang yang dilakukan
sesuai dengan prosedur postulat Koch. Ikan uji pada postulat Koch dimasukkan ke dalam 3 akuarium, antara lain: 2
akuarium untuk 2 tipe bakteri yang berbeda tipe β-hemolitik dan non-hemolitik
dan 1 akuarium untuk kontrol diinjeksi dengan BHIB dengan padat tebar ikan uji 5 ekor per akuarium. Suspensi 2 tipe bakteri patogen masing-masing diinjeksi
pada ikan uji. Ikan diamati setiap hari sampai menunjukkan gejala klinis dan kematian. Kemudian ikan diisolasi untuk diambil satu ose dari organ ginjal, mata
dan otak. Diinokulasikan dengan metode penggoresan pada media BHIA. Koloni yang tumbuh, diamati morfologi koloni, karakteristik biokimia dan sifat Gram,
untuk memastikan bakteri tersebut adalah spesies bakteri patogen yang diinfeksikan pada postulat Koch. Kemudian bakteri tersebut digores di atas agar
miring dan dilakukan kultur cair seperti yang dilakukan diatas untuk postulat Koch kembali yang dilakukan sebanyak 2 kali.
2.2.4 Uji LD
Kategori