26 berwarna kemerahan. Pencucian dilakukan sebanyak 3 kali hingga
larutan PBS menjadi hampir tidak berwarna dan jernih. Jumlah sel eritrosit yang ada dalam suspensi dihitung
menggunakan hemasitometer dengan pewarna biru trifan. Sebanyak 0.5 ml suspensi eritrosit diambil, lalu ditambah dengan PBS sebanyak
49.5 ml sehingga diperoleh volume total sebesar 50 ml. Dari suspensi ini sebanyak 20 μ l suspensi eritrosit diambil dan ditambah dengan biru
trifan sebanyak 20 μ l dan diaduk dengan mikropipet. Kemudian dilakukan penghitungan sel eritrosit dengan mikroskop pada
perbesaran 400x. Kemudian dilakukan pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi sel 2 x 10
8
selml. Jumlah sel eritrosit yang hidup harus di atas 95 agar dapat digunakan untuk uji.
Rumus perhitungan jumlah sel eritrosit menggunakan hemasitometer yaitu :
b. Pengaruh ekstrak tulang iradiasi terhadap hemolisis eritrosit
Disiapkan sel eritrosit stok dengan konsentrasi 2 x 10
8
selml dengan jumlah sel hidup lebih besar dari 95 . Suspensi sel sebanyak
800 μ l dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian
ditambahkan ekstrak sebanyak 200 μ l. Untuk masing-masing sampel dilakukan dengan tiga macam konsentrasi dan masing-masing triplo.
Disiapkan juga kontrol positif, yaitu 800 μ l eritrosit ditambah dengan 200 μ l larutan H
2
O
2
0.5 . Sedangkan kontrol negatif dibuat dengan 800 μ l eritrosit yang ditambah dengan 200 μ l PBS.
Tabung eppendorf yang berisi sel dan ekstrak tersebut kemudian diinkubasi dalam inkubator bersuhu 37
C dan kadar CO
2
5. Pengamatan dimulai dari jam ke-0 sampai jam ke-5 yang dilakukan tiap jam.
N = A x FP x 10
4
selml Keterangan : N
= Jumlah sel eritrosit FP
= Faktor pengenceran A
= Jumlah sel hidup dalam 1 kotak
27 Pengamatan dilakukan dengan mengambil tabung eppendorf
dan disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan sel darah merah. Sebanyak 100 μ l supernatan diambil
dan diplating pada 96-well plate
lalu diukur absorbansinya menggunakan Spectrophotometer microplate reader pada panjang
gelombang 450 nm. Setiap 1 jam dari jam ke-0 hingga jam ke 5, tabung eppendorf tersebut diambil dan diperlakukan seperti perlakuan
tersebut di atas.
c. Perhitungan persentase hemolisis
Nilai absorbansi yang diperoleh dari pengukuran kemudian digunakan untuk menghitung nilai persentase hemolisis eritrosit.
Rumus perhitungan persentase hemolisis eritrosit sebagai berikut: hemolisis eritrosit =
Absorbansi sampel x 100
Absorbansi kontrol positif
d. Analisis statistik
Data yang diperoleh dari pengujian ekstrak tulang ikan pepes iradiasi dibandingkan dengan data dari ekstrak tulang ikan noniradiasi
menggunakan analisis pengujian statistik. Analisis statistik yang digunakan adalah ANOVA dengan nilai selang kepercayaan 95.
Apabila terdapat perbedaan yang nyata maka dilanjutkan dengan uji Dunnet.
5. Isolasi Limfosit dan Pengujian Ekstrak Tulang Iradiasi terhadap Limfosit secara
