23 lempeng mikrokultur well plate 96 well, kertas saring, membran steril 0.20
m Sartorius, mikropipet, mikrotip 1000 µl, mikrotip 100 µl, vorteks,
hemasitometer Bright-line, syringe, hand counter, termometer, penangas air, tabung eppendorf, tabung vacutainer steril, vacutainer needle, holder,
torniquate, tabung sentrifuse steril 15 ml disposible Nunc.
C. Metode Penelitian
Metode penelitian terdiri dari tujuh tahap meliputi ekstraksi sampel, persiapan ekstrak, persiapan media kultur sel, isolasi sel eritrosit dan
pengujian pengaruh ekstrak terhadap hemolisis eritrosit, isolasi limfosit dan pengujian ekstrak terhadap proliferasi limfosit manusia, dan pengujian ekstrak
terhadap aktivitas antioksidan serta pengukuran kadar malonaldehida.
1. Ekstraksi Tulang Ikan
Ikan pepes iradiasi yang masih berada dalam kemasan dibuka, dipisahkan antara tulang dan dagingnya. Bagian tulang yang diambil
adalah tulang belakang dan tulang kepala. Bagian tulang diambil sebanyak 10 g dan dihancurkan dengan mortar sampai halus, ditambahkan dengan
aquades dengan perbandingan berat 1:2. Kemudian disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit untuk memisahkan padatan dan
cairannya. selanjutnya disaring dengan kertas saring dan diteruskan dengan membran steril 0.20 µm.
2. Persiapan ekstrak
Ekstrak tulang ikan pepes iradiasi langsung dilakukan pengenceran bertingkat sehingga diperoleh ekstrak dengan tiga pengenceran yang dapat
dilihat pada Tabel 3, yaitu konsentrasi C1, C2, dan C3. Konsentrasi C1 diperoleh dari hasil ekstraksi pada tahap 1. Konsentrasi C2 diperoleh
dengan menambahkan aquabides pada C1 dengan perbandingan 1:1,
sedangkan konsentrasi C3 diperoleh dengan menambahkan aquades steril pada ekstrak C1 dengan perbandingan 3:1. Ekstrak yang diperoleh
kemudian segera dianalisis menggunakan sel eritrosit dan sel limfosit.
24
Tabel 2 . Pengenceran ekstrak sampel
Konsentrasi Jumlah stok sampel
ml Jumlah aquabides steril
ml C1 pengenceran 0x
2 C2 pengenceran 2x
1 1
C3 pengenceran 4x 0.5
1.5
3. Persiapan Uji In Vitro
a. Persiapan Media Kultur Sel Agustinisari et al., 1997
Media yang dipergunakan untuk kultur sel adalah RPMI-1640 telah mengandung L-glutamine. Bubuk RPMI sebanyak 10.42 g
dilarutkan dalam aquabides, sehingga diperoleh 1 liter larutan RPMI- 1640. Kemudian ditambahkan 2 g NaHCO
3
sebagai buffer. Campuran larutan tersebut disterilisasi dengan membran sterilissasi
0.20 µm.
b. Persiapan PBS Phosphat Buffer Saline
Dua buah tablet PBS dilarutkan di dalam aquabides sebanyak 500 ml. Kemudian disaring dengan membran steril 0.20 µm.
c. Persiapan Serum Darah AB Nurrahman et al., 1999
Darah segar diambil dari donor yang bergolongan AB. Pengambilan darah dilakukan oleh seorang perawat di klinik Farfa,
Darmaga. Darah sebanyak 7-21 ml dimasukkan ke dalam vacuteiner steril spesial untuk isolasi serum. Darah kemudian disentrifuse selama
30 menit pada 2500 rpm hingga terpisah menjadi tiga bagian. Bagian serum yang berada di bagian atas diambil menggunakan mikropipet
dan bagian darah tidak boleh sampai terambil. Serum yang sudah dipisahkan dipanaskan dalam waterbath suhu 56˚C selama 30 menit
lalu disterilkan menggunakan membran steril 0.20 μ m.
25
4. Isolasi Sel Eritrosit dan Pengujian Pengaruh Ekstrak terhadap Hemolisis Eritrosit secara
In Vitro a. Isolasi Sel Eritrosit Zhu, 2002
Eritrosit diisolasi dari darah perifer donor dengan jenis kelamin laki-laki. Darah donor diambil sebanyak 7-15 ml secara aseptis oleh
seorang perawat di Klinik Farfa, Darmaga. Darah kemudian
dipindahkan ke dalam tabung vacutainer steril yang berisi heparin agar darah tidak menggumpal. Kemudian, darah dipindahkan ke dalam
tabung sentrifuse di dalam laminar hood secara aseptis untuk menghindari terjadinya kontaminasi mikroba dan untuk menjaga
keaseptisan proses. Pemisahan eritrosit awal dilakukan dengan sentrifuse pada
1.500 rpm selama 10 menit, dan akan terlihat ada 3 lapisan di dalam tabung. Lapisan yang paling atas berwarna kuning adalah plasma
darah, lapisan buffycoat yang terdiri dari leukosit dan platelet berada di tengah, dan di bagian bawah terdapat eritrosit yang menyusun hampir
45 dari total volume darah Gambar 3. Lapisan plasma yang ada di bagian atas dan buffycoat kemudian dibuang.
Gambar 3. Pemisahan sel darah manusia
Sel eritrosit kemudian dicuci sebanyak 3 kali menggunakan larutan PBS. Sebanyak 1 ml sel eritrosit dicuci dengan 5 ml larutan
PBS lalu disentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Eritrosit akan mengendap di dasar tabung dan larutan PBS akan
Plasma Buffycoat
Suspensi eritrosit
26 berwarna kemerahan. Pencucian dilakukan sebanyak 3 kali hingga
larutan PBS menjadi hampir tidak berwarna dan jernih. Jumlah sel eritrosit yang ada dalam suspensi dihitung
menggunakan hemasitometer dengan pewarna biru trifan. Sebanyak 0.5 ml suspensi eritrosit diambil, lalu ditambah dengan PBS sebanyak
49.5 ml sehingga diperoleh volume total sebesar 50 ml. Dari suspensi ini sebanyak 20 μ l suspensi eritrosit diambil dan ditambah dengan biru
trifan sebanyak 20 μ l dan diaduk dengan mikropipet. Kemudian dilakukan penghitungan sel eritrosit dengan mikroskop pada
perbesaran 400x. Kemudian dilakukan pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi sel 2 x 10
8
selml. Jumlah sel eritrosit yang hidup harus di atas 95 agar dapat digunakan untuk uji.
Rumus perhitungan jumlah sel eritrosit menggunakan hemasitometer yaitu :
b. Pengaruh ekstrak tulang iradiasi terhadap hemolisis eritrosit
Disiapkan sel eritrosit stok dengan konsentrasi 2 x 10
8
selml dengan jumlah sel hidup lebih besar dari 95 . Suspensi sel sebanyak
800 μ l dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian
ditambahkan ekstrak sebanyak 200 μ l. Untuk masing-masing sampel dilakukan dengan tiga macam konsentrasi dan masing-masing triplo.
Disiapkan juga kontrol positif, yaitu 800 μ l eritrosit ditambah dengan 200 μ l larutan H
2
O
2
0.5 . Sedangkan kontrol negatif dibuat dengan 800 μ l eritrosit yang ditambah dengan 200 μ l PBS.
Tabung eppendorf yang berisi sel dan ekstrak tersebut kemudian diinkubasi dalam inkubator bersuhu 37
C dan kadar CO
2
5. Pengamatan dimulai dari jam ke-0 sampai jam ke-5 yang dilakukan tiap jam.
N = A x FP x 10
4
selml Keterangan : N
= Jumlah sel eritrosit FP
= Faktor pengenceran A
= Jumlah sel hidup dalam 1 kotak
27 Pengamatan dilakukan dengan mengambil tabung eppendorf
dan disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan sel darah merah. Sebanyak 100 μ l supernatan diambil
dan diplating pada 96-well plate
lalu diukur absorbansinya menggunakan Spectrophotometer microplate reader pada panjang
gelombang 450 nm. Setiap 1 jam dari jam ke-0 hingga jam ke 5, tabung eppendorf tersebut diambil dan diperlakukan seperti perlakuan
tersebut di atas.
c. Perhitungan persentase hemolisis
Nilai absorbansi yang diperoleh dari pengukuran kemudian digunakan untuk menghitung nilai persentase hemolisis eritrosit.
Rumus perhitungan persentase hemolisis eritrosit sebagai berikut: hemolisis eritrosit =
Absorbansi sampel x 100
Absorbansi kontrol positif
d. Analisis statistik
Data yang diperoleh dari pengujian ekstrak tulang ikan pepes iradiasi dibandingkan dengan data dari ekstrak tulang ikan noniradiasi
menggunakan analisis pengujian statistik. Analisis statistik yang digunakan adalah ANOVA dengan nilai selang kepercayaan 95.
Apabila terdapat perbedaan yang nyata maka dilanjutkan dengan uji Dunnet.
5. Isolasi Limfosit dan Pengujian Ekstrak Tulang Iradiasi terhadap Limfosit secara
In Vitro. a. Isolasi Limfosit Nurrahman
et al., 1999
Darah donor sebanyak 21-27 ml diambil secara aseptis di klinik Farfa, Dramaga, Bogor oleh seorang perawat. Darah kemudian
dimasukkan ke dalam tabung vacutainer steril yang didalamnya terdapat antikoagulan. Darah kemudian dipindahkan ke dalam tabung
sentrifuse secara aseptis di dalam laminar flow hood.
28 Pemisahan limfosit awal dilakukan dengan sentrifuse darah
dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Darah akan terpisah menjadi tiga bagian, yaitu lapisan plasma, buffycoat, dan eritrosit.
Setelah itu, diambil lapisan buffycoat menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse steril yang berisi histopaque.
Buffycoat dilewatkan secara hati-hati di atas histopaque melalui dinding tabung perbandingan buffycoat dan histopaque = 1:1.
Dilakukan kembali sentrifuse 2500 rpm selama 30 menit. Diambil lapisan bagian atas dan dicuci dengan penambahan 5 ml larutan media
RPMI. Campuran ini kemudian disentrifus 1500 rpm selama 10 menit dan dicuci sebanyak dua kali, sehingga didapatkan sel limfosit.
Suspensi sel limfosit kemudian dihitung menggunakan hemasitometer dengan pewarnaan biru tripan dan ditepatkan menjadi 2 x 10
6
sel ml. Setelah itu ditambahkan serum darah AB sebanyak 10.
Gambar 4. Hasil pemisahan sel darah manusia
Rumus perhitungan
jumlah sel
eritrosit menggunakan
hemasitometer yaitu : N = A x FP x 10
4
selml Keterangan :
N = jumlah sel limfosit ml A = Jumlah sel hidup dalam 1 kotak
FP = Faktor Pengenceran Lapisan buffycoat
Sel darah merah
29
b. Pengujian terhadap Limfosit dengan Metode MTT Meiriana, 2006
Disiapkan suspensi sel limfosit dengan konsentrasi sel sebesar 2 x 10
6
selml dan ditambah dengan serum AB sebanyak 10 dari volume suspensi sel. Ekstrak sampel dimasukkan ke dalam well plate
sebanyak 20 l dan ditambahkan dengan suspensi sel limfosit sebanyak 80 l. Dibuat juga kontrol positif, yaitu LPS dan pokeweed
sebanyak 20 l ditambah dengan 80 l sel limfosit, sedangkan kontrol negatif dibuat dengan 20 l larutan RPMI ditambah dengan 80 l sel
limfosit. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37 C dan kadar CO
2
5 selama 72 jam. Enam jam sebelum masa inkubasi berakhir, kultur sel ditambahkan 10 l larutan MTT 0.5 . Setelah masa inkubasi
berakhir, pada masing-masing sumur kultur sel, ditambahkan dengan 100 l HCL-Isopropanol 0.04 N untuk melarutkan kristal formazan
yang terbentuk. Setelah itu dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 570 nm menggunakan
Spectrophotometer microplate reader. Nilai absorbansi yang terbaca bersifat proporsional
terhadap jumlah sel yang hidup. Indeks Stimulasi I.S dihitung menggunakan persamaan berikut :
IS = Absorbansi sampel
Absorbansi kontrol negatif
e. Analisis statistik
Data yang diperoleh dari pengujian ekstrak tulang ikan pepes iradiasi dibandingkan dengan data dari ekstrak tulang ikan noniradiasi
menggunakan analisis pengujian statistik. Analisis statistik yang digunakan adalah ANOVA dengan nilai selang kepercayaan 95,
apabila terdapat perbedaan yang nyata maka dilanjutkan dengan uji Dunnet.
30
6. Analisis Kapasitas Antioksidan Kubo et al., 2002
Analisis kapasitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode DPPH. Larutan DPPH dibuat dengan melarutkan 30 mg serbuk
DPPH ke dalam metanol sebanyak 25 ml. Kemudian diambil sebanyak 400 l larutan DPPH tersebut dan ditambahkan dengan 4 ml bufer asetat
dan 7.50 ml metanol. Campuran kemudian divorteks. Setelah itu ditambahkan 100 l sampel atau larutan standar. Larutan kemudian
divorteks dan didiamkan selama 20 menit di ruang gelap. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 517 nm. Kontrol negatif yang digunakan
adalah metanol, sedangkan kontrol positif yang digunakan adalah asam askorbat dengan konsentrasi 0, 50, 100, 250, 500, dan 1000 ppm Kapasitas
antioksidan diperoleh dengan menggunakan perhitungan sebagai berikut: Kapasitas antioksidan = Absorbansi kontrol negatif – Absorbansi sampel
Absorbansi kontrol negatif
7. Pengukuran Kadar Malonaldehida Seligman et al., 1977
