23 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan januari 2014 hingga bulan November 2014. Lokasi penelitian di laboratorium Farmakognosi Fitokimia
FKIK dan Laboratorium Pusat Laboratorium Terpadu Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.2 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah blender, peralatan maserasi botol coklat, erlenmeyer SCHOT Duran, corong, kertas saring,
kapas, aluminium-foil klin pak, label, lemari pendingin SANYO, gelas kimia SCHOT Duran, gelas ukur YZ, vakum rotari evaporator
EYELA, alat-alat gelas, timbangan analitik AND GH-202 dan Wigen Hauser, ose, pinset, inkubator, laminar air flow, hot plate Wigen Hauser,
autoklaf dan tabung reaksi Pyrex.
3.3 Bahan 3.3.1 Bahan uji
Sampel yang digunakan sebagai bahan uji adalah simplisia kering daun Garcinia benthami Pierre yang diperoleh dari Kebun Raya Bogor
dan determinasi oleh ahli botani Hebarium Bogoriense, LIPI Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor
. 3.3.2 Bahan Kimia
Pelarut organik n-heksana non polar, etil asetat semi polar, dan
metanol polar, pereaksi Mayer, Bauchardat, Dragendorff, asam sulfat pekat, asam klorida pekat HCl P, serbuk Mg, etanol 96, besi III klorida
FeCl
3
, kloroform, natrium hidroksida NaOH, NaCl fisiologis dan DMSO Dimetil Sulfoksida merck.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.3. Bahan uji antimikroba Mikroba uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus ATCC
25923 dan Escherichia coli ATCC 25922. Adapun antibiotik pembanding adalah kloramfenikol. Media yang digunakan adalah Nutrient Agar NA
dan Nutrient Broth NB.
3.4 Cara kerja
3.4.1 Penyiapan Bahan Amelia, 2011 Sampel yang digunakan adalah daun Garcinia benthami Pierre
didapatkan dalam keadaan sampel kering diproleh dari kebun raya Bogor yang sebelumnya telah dilakukan dengan pengumpulan bahan berupa daun
segar sebanyak 2 kilogram pada bulan Februari 2014 dan identitas biologi tumbuhan ini ditentukan oleh ahli botani Hebarium Bogoriense, LIPI
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor. Selanjutnya
dilakukan sortasi
basah serta
dicuci untuk
menghilangkan pengotor yang masih menempel pada bahan. Sortasi dilakukan untuk memisahkan kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing
sehingga dapat mengurangi jumlah pengotor yang ikut terbawa dalam bahan uji, setelah itu dikeringkan di Balai Peneliti Tanaman Rempah dan
Obat Bogor dengan mengunakan Oven suhu 40ºC selama 5 hari. Daun yang sudah kering didapatkan sebanyak 1 kilogram.
Simplisia yang telah kering disortasi kembali dari kotoran-kotoran yang tertinggal. Simplisia yang telah disortir, dipotong menjadi bagian
kecil dan diblender menjadi serbuk halus. 3.4.2 Pembuatan Ekstrak Amelia, 2011
Serbuk simplisia daun Garcinia benthami Pierre yang digunakan dalam percobaan sebanyak 700 gram dimasukkan kedalam alat maserasi
botol coklat. Ekstrak dibuat dengan metode remaserasi bertingkat dengan mengunakan pelarut yang memiliki kepolaran meningkat yaitu pelarut
n-heksana non-polar, etil asetat semi polar, dan metanol polar. Proses remaserasi didiamkan selama 2-3 hari sambil sesekali dilakukan
pengadukan. Setelah 2-3 hari maserat disaring menggunakan corong yang
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dilapiskan dengan kapas selanjutnya disaring dengan menggunakan kertas saring agar tersaring sempurna.
Maserat pertama yang didapatkan adalah maserat n-heksana. Ampas kemudian diangin-anginkan agar bebas dari pelarut n-heksana lalu
dimaserasi kembali dengan etil asetat, setelah didapatkan maserat etil asetat, ampas dimaserasi kembali menggunakan pelarut metanol sampai
didapatkan maserat metanol. Masing-masing maserat yang didapatkan kemudian diuapkan pelarutnya mengunakan vakum rotary evaporator
dengan suhu 40ºC dan didapatkan ekstrak kental dari masing-masing pelarut. Ekstrak yang didapatkan kemudian disimpan di dalam lemari
pendingin dibagian refrigerator. Keuntungan ekstraksi dengan cara maserasi adalah pengerjaan dan
peralatan yang digunakan sederhana, sedangkan kerugiannya yakni cara pengerjaannya lama, membutuhkan pelarut yang banyak dan penyarian
kurang sempurna. 3.4.3 Rendemen Total Ekstrak Garcinia benthami Pierre
Rendemen ekstrak daun Garcinia benthami Pierre total dihitung dengan membandingkan berat awal serbuk simplisia dengan berat akhir
ekstrak daun Garcinia benthami Pierre total yang diperoleh Depkes, 2002.
Rendemen : bobot ekstrak total yang diperoleh x 100 Bobot serbuk simplisia yang diekstraksi
3.4.4 Penapisan Fitokimia Penapisan fitokimia dilakukan untuk melihat kandungan golongan
senyawa yang terdapat didalam ekstrak daun Garcinia benthami Pierre. Pengujian fitokimia meliputi :
a. Alkaloid Untuk mengidentifikasi alkaloid, ekstrak dilarutkan dengan etanol
96 kemudian ditambahkan asam klorida encer 2 N. Filtrat yang diperoleh disaring kemudian diidentifikasi menggunakan pereaksi Mayer,
Bouchardat, Dragendorff. Pada penambahan Mayer, hasil positif ditandai dengan terbentuknya endapan berwarna putih atau kuning. Hasil positif
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Dragendorff ditunjukkan dengan terbentuknya endapan berwarna merah bata. Penambahan Bouchardat memberikan hasil positif jika terbentuk
endapan coklat sampai hitam Materia Medika, 1980. b. Saponin
Ekstrak ditambahkan 5 mL aquadest panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Hasil positif ditunjukkan dengan
terbentuknya buih yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm dan pada penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih
tidak hilang Materia medika, 1980. c. Tanin
Sebanyak 0,5 gram ekstrak dimasukan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan dengan FeCl
3
0,1 . Terbentuknya warna biru- hitam, hijau atau biru hijau dan endapan menunjukan adanya tanin Fanswoth, 2012.
d. Flavonoid Ekstrak dilarutkan dalam 1 mL etanol 96 kemudian ditambahkan
sebanyak 0,1 gram serbuk Mg dan 5 tetes asam klorida pekat. Jika terbentuk warna merah jingga sampai merah ungu, menunjukkan adanya
flavonoid. Jika terbentuk warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon dan auron Materia Medika, 1980.
e. Kuinon Sejumlah lebih kurang 5 mL larutan ekstrak ditambah natrium
hidroksida 1N, adanya kuinon ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah Fanswoth, 1969.
f. Steroid Terpenoid Sejumlah 1 mL larutan ekstrak ditambah 0,5 mL anhidrida asetat
dan 0,5 mL CHCl
3
selanjutnya ditambah H
2
SO
4
pekat setetes demi setetes sebanyak 0,2 mL ke dasar tabung dan diamati terjadinya warna ungu
Materia medika, 1980.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.5 Pengujian Aktivitas Antimikroba ekstrak n-heksana, etil asetat dan ekstrak metanol Daun Garcinia benthami Pierre dengan Metode Dilusi.
3.4.5.1 Sterilisasi Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian uji aktivitas antimikroba
ini disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat gelas dan media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit, ose dan pinset dibakar dengan
pembakaran diatas api langsung Deby et al., 2012.
3.4.5.2 Pembuatan Medium Deby et al., 2012. a. Medium Nutrient Agar NA
NA ditimbang sebanyak 2,3 gram dilarutkan dalam 1 liter aquades. Setelah semua bahan tercampur, medium dipanaskan hingga larut
sempurna, lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.
b. Medium Nutrient Broth NB Sebanyak 8 gram serbuk NB ditambah 1 liter aquades dipanaskan
sampai mendidih kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit, setelah agak dingin disimpan dalam lemari pendigin dan
dapat digunakan. 3.4.5.3 Persiapan Inokulum
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
a. Peremajaan Bakteri Uji Bakteri uji diremajakan pada medium Nutrient Agar NA miring
steril. Mikroba uji diinokulasi sebanyak satu ose ke dalam medium NA dan inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Peremajaan dilakukan dalam
kondisi steril didalam Laminar Air Flow LAF Deby et al., 2012. b. Pembuatan Suspensi Bakteri Dwyana, et al., 2012.
1. Pembuatan suspensi bakteri Staphylococcus aureus Bakteri uji yang telah diremajakan selama 24 jam, masing-masing
diambil satu ose kemudian disuspensikan kedalam larutan NaCl fisiologis 0,9 steril, setelah itu dihomogenkan. Kemudian
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
suspensi diukur dengan menggunakan spektrofotometer, sebagai blanko digunakan NaCl 0,9 pada panjang gelombang 625 nm.
2. Pembuatan suspensi bakteri Escherichia coli Bakteri uji yang telah diremajakan pada suhu 37°C selama 24 jam,
masing-masing diambil satu ose kemudian disuspensikan kedalam larutan NaCl 0,9 steril, setelah itu dihomogenkan. Kemudian
suspensi diukur asorbansinya menggunakan spektrofotometer, sebagai blanko digunakan NaCl 0,9 pada panjang gelombang
625 nm. 3.4.5.4 Penyiapan larutan induk uji ekstrak n-heksana, ekstrak etil asetat dan
metanol. Larutan uji dibuat dengan melarutkan ekstrak Garcinia benthami
Pierre dengan pelarut DMSO 100 dengan cara ditimbang 0,02 gram ekstrak dilarutkan dalam 10 mL DMSO 100 Larutan induk 2000
µgmL. Konsentrasi larutan uji yang digunakan adalah 1000µgmL, 500µgmL, 250µgmL; 125µgmL, dan 62,5µgmL Paturusi et al., 2011.
3.4.5.5 Pembuatan Larutan kloramfenikol Wardani et al., 2012. Ditimbang 1 mg kloramfenikol. Dilarutkan dalam 1 mL aquades
steril. Kemudian diambil dengan cara : Sebamyak 0,5 mL larutan kloramfenikol ditambahkan 0,1 mL bakteri uji 10
6
CFUMl dan di ad 0,4 mL nutrient broth.
3.4.5.8 Pembuatan Larutan Kontrol Negatif Wardani et al., 2012. Sebanyak 0,5 mL NB dalam tabung reaksi ditambahkan 0,5 mL
larutan DMSO vortex diambil 0,5 mL dibuang ditambahkan 0,1 bakteri uji 10
6
CFUmL dan di ad 0,4 mL NB. 3.4.5.9 Penentuan Aktivitas Antimikroba Daun Garcinia benthami Pierre terhadap
Mikroba Uji Metode Dilusi Cair Wardani et al., 2012. Metode dilusi cair dilakukan dengan menyiapkan beberapa tabung
rekasi yang sudah steril, larutan uji dan bakteri uji sebagai kontrol negatif, larutan antibiotik pembanding dan bakteri uji sebagai kontrol positif.
Selanjutnya tiap-tiap tabung diisi dengan 0,5 mL medium NB. Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL larutan uji pada tabung reaksi pertama di vortex. dari
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
tabung pertama diambil 0,5 mL dipindahkan kedalam tabung kedua dan seterusnya sampai konsentrasi 62,5. Lalu diambil 0,5 mL larutan pada
tabung terakhir
dan dibuang,
sehingga masing-masing
tabung berisi 0,5 mL. Kemudian masing-masing tabung ditambahkan 0,1 mL
suspensi bakteri dan 0,4 mL Nutrient Broth dengan volum total masing- masing tabung adalah 1 mL dan di vortex. Selanjutnya diinkubasi dalam
inkubator pada suhu 37ºC selama 24 jam. Diamati kekeruhan dan dibandingkan dengan kontrol positif kloramfenikol, kontrol negatif
DMSO dan kontrol media. Kosentrasi paling rendah yang tidak menunjukan kejernihan adalah KHM.
Aktivitas antimikroba dari ekstrak tanaman diklasifikasikan kuat jika nilai KHM 100 µgmL, sedang jika 100 KHM ≤ 625 µgmL dan lemah
jika nilai KHM 625 µgmL Kuete et al., 2011. Untuk mengetahui KBM, dilakukan penggoresan dari tabung
larutan 1000 µgmL, 500 µgmL, 250 µgmL, 125 µgmL, 62,5 µgmL dari KHM pada media padat, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C
selama 24 jam. Setelah 24 jam, Kosentrasi paling rendah yang tidak menunjukan adanya pertumbuhan koloni bakteri pada media padat adalah
KBM.
30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 1V HASIL DAN PEMBAHASAN