b. Pengaruh jumlah inokulum BAL terhadap kemampuan penempelannya
pada permukaan usus tikus dan kemampuan kompetisinya dengan EPEC
Pengujian ini menggunakan tiga jenis perlakuan yaitu 1 potongan usus yang dipaparkan pada BAL, 2 potongan usus yang dipaparkan pada EPEC, dan
3 potongan usus yang dipaparkan pada BAL dan EPEC secara bersamaan. Pada setiap perlakuan ada dua jenis konsentrasi inokulum BAL yang digunakan yaitu
10
6
cfuml dan 10
8
cfuml. Potongan usus tikus diinkubasi selama 60 menit pada semua perlakuan. Setelah itu, potongan usus diambil dan dibilas dengan PBS
sebanyak 2 kali. Usus yang telah dibilas kemudian dianalisis jumlah total BAL dan total E. coli. Jumlah inokulum BAL yang memberikan hasil penempelan yang
lebih baik kemudian digunakan pada uji selanjutnya.
c. Uji Eksklusi dan Displacement
Uji eksklusi bertujuan untuk mengetahui kemampuan BAL yang telah menempel untuk bertahan pada permukaan usus tikus. Potongan usus dipaparkan
terhadap BAL lebih dahulu selama 60 menit kemudian dicuci dan dipaparkan pada EPEC selama 60 menit. Sedangkan uji displacement bertujuan untuk
mengetahui kemampuan BAL untuk menggantikan bakteri patogen yang telah menempel pada permukaan usus. Pada uji displacement, potongan usus
dipaparkan dulu pada EPEC selama 60 menit kemudian dicuci dan dipaparkan pada BAL selama 60 menit. Pengujian ini menggunakan empat perlakuan yaitu
1 potongan usus yang dipaparkan pada BAL, 2 potongan usus yang dipaparkan pada EPEC, 3 potongan usus yang dipaparkan pada BAL kemudian dipaparkan
pada EPEC, dan 4 potongan usus yang dipaparkan pada EPEC kemudian dipaparkan pada BAL. Jumlah inokulum BAL yang digunakan adalah 10
8
cfuml sedangkan jumlah inokulum EPEC yang digunakan adalah 10
6
cfuml. Usus kemudian dihitung jumlah total BAL dan total E. coli.
d. Preparasi Sampel Untuk Analisis SEM Scanning Electron Microscope
modifikasi Savage Blumershine 1974
Satu ekor tikus tiap kelompok dibedah dan diambil bagian kolonnya. Kolon dibersihkan dari isinya dan segera direndam dalam larutan 2
glutaraldehyde dalam buffer phosphate pada pH 7.3 dan suhu 4
o
C yang kemudian disimpan selama 2 hari tahap prefiksasi. Kemudian pada tahap fiksasi, sampel
direndam dalam tannic acid 2 selama 6 jam, selanjutnya dicuci dengan cacodylate buffer
selama 15 menit sebanyak 4 kali. Kemudian dicuci dengan osmium tetraoksida 1 selama 1-4 jam dan dicuci dengan akuades selama 15
menit sebanyak 1 kali. Pada tahap dehidrasi, sampel direndam dengan alkohol konsentrasi bertingkat, yaitu 50 selama 5 menit sebanyak 4 kali, 70 selama 20
menit, 85 selama 20 menit, 95 selama 20 menit, dan alkohol absolut selama 10 menit sebanyak 2 kali. Kemudian dibekukan dalam freezer sampai beku,
selanjutnya dimasukkan freezed drier sampai kering. Sampel siap diamati dengan SEM. Permukaan usus yang diamati adalah permukaan usus kontrol dan usus
yang dipapar dengan A27, B16, R14, R23, dan EPEC.
e. Analisis statistik
Pengolahan data untuk jumlah total bakteri pada permukaan usus, pengaruh waktu paparan, uji hidrofobisitas, uji autoagregasi, dan uji kompetisi
dilakukan dengan SPSS 13.0 dan dianalisis dengan uji One Way ANOVA dengan uji Duncan sebagai uji lanjutan.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
1. EVALUASI METODE PENGUJIAN SIFAT PENEMPELAN BAL
PADA MUKUS BROILER DAN USUS TIKUS A.
Penempelan BAL pada Mukus Broiler
Penempelan pada mukus merupakan tahap pertama dari proses kolonisasi bakteri di dalam usus. Interaksi dengan mukosa akan meningkatkan kesempatan
terjadinya kolonisasi karena dapat mencegah lepasnya bakteri karena laju aliran yang tinggi pada usus halus Ouwehand et al. 1999. Uji penempelan BAL pada
mukus hanya dilakukan pada tiga isolat BAL yaitu A15, A29, dan R21. Pada tahap pertama yang dilakukan adalah menentukan kombinasi antara
lama waktu inkubasi BAL pada lapisan mukus dengan lama waktu ekstraksi BAL yang menempel pada lapisan mukus. Jumlah BAL yang menempel pada mukus
dan lepas pada waktu ekstraksi dinyatakan sebagai persen penempelan. Menurut Nitisinprasert et al. 2006, lama waktu ekstraksi merupakan titik kritis dari
metode ini untuk menentukan jumlah sel bakteri yang menempel pada mukus. Isolat yang digunakan dalam uji pertama ini adalah R21. Lama inkubasi BAL
pada lapisan mukus adalah selama 60 menit, 90 menit, dan 120 menit, sedangkan lama waktu ekstraksi yang digunakan adalah 90, 120, dan 120 menit. Hasil
penghitungan selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 1-3. Gambar 4 menunjukkan bahwa lama ekstraksi tidak berpengaruh terhadap
jumlah sel bakteri yang terlepas. Pada Gambar 4A, waktu ekstraksi optimum diperoleh pada menit ke-120. Penambahan waktu ekstraksi menjadi 150 menit
ternyata tidak dapat meningkatkan jumlah sel yang terlepas. Hal ini juga terlihat dari Gambar 4B dimana semakin lama waktu inkubasi maka jumlah sel yang
terlepas semakin sedikit. Jumlah sel bakteri terlepas yang paling banyak diperoleh dengan ekstraksi selama 90 menit pada lapisan mukus yang diinkubasi R21
selama 120 menit Gambar 4C. Pada Gambar 5 dapat dilihat bahwa semakin lama waktu inkubasi BAL pada lapisan mukus maka semakin tinggi persentase
penempelannya. Persentase penempelan tertinggi diperoleh setelah penempelan selama 120 menit. Hal ini karena kesempatan BAL untuk berinteraksi dengan
mukus semakin lama.
Kategori