Penghitungan jumlah total BAL dan total E. coli pada permukaan usus tikus Usus yang telah dibilas diswab dengan cotton bud steril dengan luasan 1
cm
2
dan dimasukkan ke dalam 10 ml larutan pengencer. Setelah itu, tabung divorteks selama 1 menit untuk melepaskan bakteri yang menempel pada cotton
bud . Pengamatan jumlah sel yang menempel dilakukan dengan metode plating
dengan berbagai serial pengenceran pada media MRSA dan EMBA. Kontrol yang digunakan adalah potongan usus yang direndam di dalam larutan pengencer
selama 1 jam. Kenaikan total BAL dan dihitung sebagai selisih antara jumlah BAL pada kontrol dengan jumlah BAL pada sampel. Penurunan total E. coli
dihitung sebagai selisih antara jumlah E. coli pada kontrol dengan jumlah E. coli pada sampel.
2. Pengujian Sifat Penempelan BAL
a. Uji hidrofobisitas modifikasi Mishra Prasad 2005
Bakteri ditumbuhkan dalam MRSB pada suhu 37°C selama 16-18 jam. Kemudian sel dipanen dengan cara sentrifugasi pada 5000 rpm selama 15 menit.
Endapan yang diperoleh dicuci dengan buffer PUM dan kemudian disuspensikan ke dalam buffer PUM sampai mencapai jumlah 10
8
cfuml. Suspensi tersebut kemudian diukur nilai absorbansi awal pada 600 nm A. Lima mililiter suspensi
sel dalam PUM buffer dipindahkan ke dalam tabung yang bersih dan kering dengan dasar bundar kemudian ditambahkan hidrokarbon yang berbeda-beda
xylene, etil asetat, dan kloroform sebanyak 1 ml dan dicampur dengan divorteks pada kecepatan tinggi selama 1 menit. Kemudian tabung reaksi didiamkan selama
1 jam pada suhu 37°C untuk pemisahan fase. Fase aqueous dipindahkan dengan hati-hati menggunakan pipet steril untuk diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 600 nm A .
Perubahan Σ BAL log cfucm
2
= rata-rata BAL sampel – rata-rata BAL kontrol Perubahan
Σ E. coli log cfucm
2
= rata-rata E. coli sampel – rata-rata E coli
Penurunan nilai absorbansi pada fase aqueous dinyatakan sebagai nilai hidrofobisitas permukaan H dengan menggunakan persamaan berikut.
H = A-A
A x 100 A : nilai absorbansi awal pada 600 nm
A : nilai absorbansi akhir pada 600 nm
b. Uji Autoagregasi
Uji autoagregasi visual Jankovic et al. 2003 Kultur BAL ditumbuhkan pada MRS broth Oxoid selama semalam pada
suhu 37°C. Agregasi dinilai positif jika pada broth didapatkan agregat yang jelas partikel seperti pasir membentuk endapan didasar tabung dan supernatan akan
terlihat jernih. Uji autoagregasi kuantitatif Kos et al. 2003
BAL ditumbuhkan pada MRSB selama 18 jam pada 37°C. Sel BAL dipanen dengan sentrifugasi pada 5000 g selama 15 menit. Endapan yang
diperoleh dicuci 2 kali dan disuspensikan ke dalam PBS sampai mencapai jumlah 10
8
cfuml. Autoagregasi ditentukan dengan mengukur absorbansi awal 0 jam dan absorbansi akhir 5 jam setelah inkubasi pada suhu ruang. Pengukuran
absorbansi dilakukan dengan mengambil sebanyak 0.1 ml suspensi bagian atas dan dimasukkan ke dalam 3.9 ml PBS kemudian diukur absorbansinya pada 600
nm. Persentase autoagregasi dinyatakan sebagai berikut: Autoagregasi = 1- A
t
A x 100
A
t
= absorbansi pada waktu t = 5 jam A
= absorbansi pada t = 0
c. Penempelan BAL pada sel epitel usus tikus Makinen et al. 1983
