Persiapan Sampel Analisis Kadar Protein Bollag dan Edelstein, 1991

12 METODOLOGI PENELITIAN

A. Bahan dan Alat

Bahan-bahan dan alat-alat yang digunakan antara lain bahan untuk analisis proksimat, ekstraksifraksinasi, konfirmasi waktu inkubasi optimum enzim mannanase, analisis kadar protein, dan analisis SDS-PAGE. Bahan untuk analisis proksimat antara lain heksana, kertas saring, kalium sulfat, asam sulfat, NaOH-Na 2 S 2 O 3 , asam borat, dan HCl. Bahan untuk ekstraksifraksinasi dan konfirmasi waktu inkubasi optimum enzim mannanase antara lain akuades, HCl, NaCl, NaOH, etanol, aseton, enzim mannanase, buffer fosfat, dan buffer asetat. Bahan untuk analisis kadar protein antara lain Coomasie Briliant Blue G250, BSA, asam fosfat, kertas saring, dan etanol. Bahan untuk analisis SDS-PAGE antara lain akrilamid, bis-akrilamid, tris-amino metan, SDS, amonium peroksodisulfat, TEMED, merkaptoetanol, gliserol, indikator bromophenol blue, glisin, metanol, formaldehida, natrium tiosulfat, perak nitrat, dan natrium karbonat. Alat yang digunakan antara lain alat sentrifugasi, spektrofotometer, aparatus elektroforesis, glass wool, sarung tangan, masker, eppendorf, pippette tips , pH-meter, labu Kjeldahl, labu lemak, penyaring vakum, hot plate , penangas air, alat destilasi, aparatus Soxhlet, buret, erlenmeyer, dan tabung reaksi.

B. Metode Penelitian

1. Persiapan Sampel

Sampel bungkil kelapa yang digunakan diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia-LIPI yang didapatkan dari Jambi. Sebelum dilakukan ektraksi protein, bungkil kelapa dihilangkan terlebih dahulu kandungan lemaknya dengan menggunakan heksana 25L5 kg, 5 sirkulasi. Bungkil kelapa yang telah dihilangkan lemaknya Defatted Copra Meal DCM diblender kering untuk memperkecil ukuran partikel bungkil kelapa sehingga mempermudah proses ekstraksi protein. 13

2. Analisisis Proksimat

a. Analisis Kadar Air AOAC, 1995

Sebanyak 2-3 g contoh ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam cawan alumunium. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam oven yang bersuhu 105 o C selama 3 jam. Setelah selesai, sampel ditimbang kembali bobotnya. b. Analisis Kadar Abu AOAC, 1995 Sebanyak 2-3 g contoh ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam pinggan poselin. Sampel dipanaskan dengan menggunakan hot plate hingga tidak terlihat lagi adanya asap. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam tanur yang bersuhu 600 o C selama 3 jam. Setelah selesai, sampel yang telah diabukan didingikan dalam desikator kemudian ditimbang kembali bobotnya.

c. Analisis Kadar Lemak, Metode Soxhlet AOAC, 1995

Sebanyak 1-2 g contoh ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam selongsong kertas saring yang dialasi dengan kapas. Selongsong kertas saring disumbat lalu dikeringkan pada oven pada suhu 105 o C selama 1 jam, kemudian sampel dimasukkan ke dalam alat Soxhlet. Ekstraksi dilakukan menggunakan heksana sebanyak 150 ml selama 6 jam. Heksana disuling kemudian labu lemak dikeringkan pada oven dengan suhu 105 o C. Labu lemak selanjutnya ditimbang untuk menentukan kadar lemak dalam bahan.

d. Analisis Kadar Nitrogen, Metode Mikro Kjeldahl AOAC, 1995

Sebanyak 1-2 g contoh ditimbang kemudian dimasukan ke dalam labu Kjeldahl, lalu ditambahkan 1,9 + 0,1 g K 2 SO 4 , 40 + 10 ml H 2 O, dan 2,0 + 0,1 ml H 2 SO 4 . Kemudian contoh dididihkan sampai cairan jernih. Larutan jernih ini kemudian dipindahkan ke dalam alat destilasi. Labu Kjeldahl dicuci dengan air kemudian air cuciannnya dimasukan kedalam alat destilasi dan ditambahkan 8-10 ml larutan NaOH – Na 2 S 2 O 3 . Di bawah kondensor diletakan erlenmeyer yang berisi 5 ml larutan H 3 BO 3 jenuh dan 2-4 tetes indikator campuran 2 bagian metil 14 merah 0,2 dan 1 bagian biru metilen 0,2 dalam alkohol. Ujung tabung kondensor harus terendam dalam larutan H 3 BO 3 jenuh. Kemudian isi erlemeyer diencerkan sampai 50 ml lalu dititrasi dengan HCl 0,02 sampai terjadi perubahan warna menjadi abu.

e. Analisis Kadar Serat Kasar AOAC, 1995

Sebanyak 2 g contoh ditimbang kemudian dihilangkan lemaknya dengan menggunakan metode Soxhlet, sebagai pelarutnya digunakan heksana. Secara kuantitatif, sampel dipindahkan ke dalam erlenmeyer 600 ml kemudian ditambahkan 0,5 g asbes dan 2 tetes zat anti buih. Selanjutnya ditambahkan 200 ml asam sulfat mendidih. Sampel dipanaskan dalam pendingin balik selama 30 menit. Suspensi selanjutnya disaring dengan menggunakan kertas saring dan dibilas dengan menggunakan air mendidih hingga air bilasan tidak lagi bersifat asam. Secara kuantitatif, kertas saring dipindahkan ke dalam erlenmeyer dan dicuci dengan menggunakan 200 ml NaOH mendidih. Sampel kemudian dididihkan selama 30 menit dalam pendingin balik. Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring yang telah diketahui beratnya dan dicuci dengan menggunakan K 2 SO 4 10. Residu dicuci dengan menggunakan air mendidih kemudian dengan alkohol 95. Kertas saring kemudian dikeringkan dalam oven dan ditimbang bobotnya.

f. Analisis Kadar Bahan Ekstrak Tanpa Nitrogen BETN, metode

by difference AOAC, 1995 Kadar BETN dihitung dengan cara menyelisihkan 100 dengan kadar air, kadar abu, kadar lemak, kadar protein, dan kadar serat kasar yang telah diperoleh sebelumnya.

3. Konfirmasi Waktu Inkubasi Optimum Mannanase

Sebanyak 0,1 g sampel dicampur dengan 10 µl larutan enzim mannanase dan 90 µl buffer asetat 0,5 M pH 5,3, selanjutnya campuran diinkubasi pada suhu 30 o C. Lama inkubasi divariasi menjadi 0; 0,5; 1; 1,5; dan 2 jam dengan kecepatan agitasi sebesar 125 rpm. Campuran 15 kemudian disentrifugasi pada kecepatan 4000 xg selama 10 menit pada suhu 4 o C. Pelet kemudian dicampur dengan buffer fosfat 0,05 M pH 7,0 dan divortex dengan kuat selama 5 menit untuk mendapatkan total proteinnya. Sentrifugasi kembali dilakukan, lalu supernatan yang didapatkan diukur konsentrasi proteinnya dengan menggunakan metode Bradford . Diagram alir konfirmasi waktu inkubasi optimum mannanase dapat dilihat pada Gambar 4 di bawah ini. Gambar 4. Diagram alir konfirmasi waktu inkubasi optimum mannanase 4. Fraksinasi Protein Adebiyi et al., 2009 a. Metode Non-enzimatis Fraksinasi protein dilakukan pada suhu ruang 27 o C dengan menggunakan shaker berkecepatan 250 rpm. Sebanyak 20 g bungkil kelapa yang telah dihilangkan kadar lemaknya Defatted Copra Meal DCM diekstrak dengan menggunakan shaker dalam 80 ml air destilata selama 1 jam. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 4000 xg selama 15 menit pada suhu 4 o C. Supernatan yang 0,1 g bungkil + 10 µ l enzim + 90 µ l buffer asetat 0,5 M; pH 5,3 Inkubasi T = 30 o C t= 0; 0,5; 1; 1,5; dan 2 jam Sentrifuge 4000 xg , 10 min, 4 o C Pelet 1 ml buffer fosfat 0,05 M; pH 7,0 Sentrifuge 4000 xg , 10 min, 4 o C Pelet Protein Total Analisis Bradford 16 didapatkan merupakan fraksi kasar albumin ALB. Tahap tersebut diulangi kembali, namun dengan menggunakan 120 ml air destilata. Residu hasil fraksinasi albumin kemudian diekstrak menggunakan 80 ml larutan NaCl 5 dengan menggunakan shaker selama 1 jam, kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 4000 xg selama 15 menit pada suhu 4 o C. Supernatan yang didapatkan merupakan fraksi kasar globulin GLB. Tahap tersebut diulangi kembali namun dengan menggunakan 120 ml air destilata. Untuk mendapatkan fraksi kasar glutelin GLT, residu hasil fraksinasi globulin diekstrak dengan menggunakan larutan basa encer NaOH 0,02 M pH 11 dengan volume dan metode fraksinasi yang serupa. Fraksi prolamin PRO didapatkan dengan mengekstrak residu hasil fraksinasi kasar glutelin, menggunakan larutan etanol 70 dengan volume 60 ml pada ekstraksi pertama dan 120 ml pada ekstraksi kedua. Metode fraksinasi yang digunakan mengacu pada metode fraksinasi sebelumnya. Masing-masing ekstrak kasar protein disentrifugasi dengan kecepatan 4000 xg selama 15 menit pada suhu 4 o C. Supernatan kemudian disaring menggunakan glass wool. Fraksi albumin, globulin, dan glutelin kemudian diatur pH-nya dengan menggunakan HCl 0,01 M hingga mencapai pH isoelektriknya, yaitu 4,1; 4,3; dan 4,8. Fraksi selanjutnya diistirahatkan selama 1 jam kemudian disentrifugasi pada kecepatan 4000 xg selama 15 menit pada suhu 4 o C. Residu yang diperoleh dicuci menggunakan air destilata dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan yang sama. Pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Residu kemudian dilarutkan dalam buffer fosfat 0,05M untuk dilakukan analisis lebih lanjut. Berbeda dengan fraksi protein yang lainnya, fraksi protein prolamin diendapkan dengan menambahkan sejumlah aseton secara bertahap, sebanyak 3 tahap. Diagram alir fraksinasi protein bungkil menggunakan metode non-enzimatis dapat dilihat pada Gambar 5. 17 20 g bungkil kelapa 80 ml H 2 O Shaking 250 rpm, 1 jam Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Ekstrak albumin Ekstrak globulin Ekstrak glutelin Ekstrak prolamin Residu D 120 ml H 2 O 120 ml NaCl 5 120 ml NaOH 0.02M 120 ml etanol 70 80 ml NaCl 5 Shaking 250 rpm, 1 jam Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Residu A 80 ml NaOH 0.02M Shaking 250 rpm, 1 jam Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Residu B Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Filter glass wool Atur pH=4.10 albumin, 4.30 globulin, dan 4.80 glutelin. Istirahatkan 1 jam Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Pellet Cuci dengan H 2 O 2X Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Pellet Larutkan dalam buffer fosfat 0.02 M, pH 7.00 Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Filter glass wool Tambah aseton threefold Istirahatkan 1 jam 60 ml etanol 70 Shaking 250 rpm, 4 jam Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Residu C Gambar 5. Diagram alir fraksinasi protein bungkil kelapa metode non-enzimatis Adebiyi et al., 2009 18

b. Metode Enzimatis

Sebelum tahapan fraksinasi dilakukan, terlebih dahulu bungkil kelapa diberi perlakuan enzim mannanase. Enzim mannanase yang digunakan memiliki konsentrasi 1 dalam buffer asetat 0,5 M; pH 5,3. Waktu inkubasi yang digunakan adalah berdasarkan hasil konfirmasi waktu inkubasi optimum enzim mannanase. Telah diketahui banwa suhu inkubasi optimum enzim ini adalah 30 – 33 o C. Sebanyak 20 g bungkil kelapa yang telah dihilangkan kadar lemaknya Defatted Copra Meal DCM ditambahkan 80 ml enzim mannanase 1. Kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker dengan kecepatan 125 rpm pada suhu 30 o C. Sentrifugasi, pada kecepatan 4000 xg selama 15 menit pada suhu 4 o C, dilakukan setelah tahapan inkubasi selesai dilakukan. Supernatan dipisahkan dan ekstraksi dilakukan pada pelet mengikuti metode non-enzymatic. Diagram alir fraksinasi protein bungkil kelapa menggunakan metode enzimatis dapat dilihat pada Gambar 6.

5. Analisis Kadar Protein Bollag dan Edelstein, 1991

Larutan stok dibuat dengan mencampurkan 100 ml etanol 95, 200 ml asam fosfat 88, dan 350 mg Coomasie Briliant Blue. Reagen Bradford dibuat dengan mencampurkan 425 ml air destilata, 15 ml etanol 95, 30 ml asam fosfat 88, dan 30 ml larutan stok. Jika diperlukan, penyaringan menggunakan kertas Whatman nomor 1 dapat dilakukan. Larutan protein yang digunakan sebagai standar adalah Bovine Serum Albumin BSA dengan konsentrasi 100µg1ml. Sebanyak 2,5 mg kristal BSA ditimbang kemudian dilarutkan dalam 10 ml air destilata. Selanjutnya dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml dan ditepatkan volumenya hingga 25 ml menggunakan air destilata. Kurva standar makro dibuat dengan memipet sebanyak 20, 40, 60, 80, dan 100 µl larutan BSA, sedangkan kurva standar mikro dibuat dengan memipet sebanyak 5, 10, 15, 20, dan 25 µl larutan BSA. Larutan ditepatkan volumenya menjadi 100 µl menggunakan air destilata, dan 19 Gambar 6. Diagram alir fraksinasi protein bungkil kelapa metode enzimatis modifikasi Adebiyi et al., 2009 20 g bungkil kelapa 80 ml mannanase 1 buffer asetat 0.5 M, pH 5.3 Shaking 125 rpm, 30 o C, 1.5 jam Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Residu awal 80 ml H 2 O Shaking 250 rpm, 1 jam Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Ekstrak albumin Ekstrak globulin Ekstrak glutelin Ekstrak prolamin Residu D 120 ml H 2 O 120 ml NaCl 5 120 ml NaOH 0.02M 120 ml etanol 70 80 ml NaCl 5 Shaking 250 rpm, 1 jam Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Residu A 80 ml NaOH 0.02M Shaking 250 rpm, 1 jam Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Residu B Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Filter glass wool Atur pH=4.10 albumin, 4.30 globulin, dan 4.80 glutelin. Istirahatkan 1 jam Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Pellet Cuci dengan H 2 O 2X Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Pellet Larutkan dalam buffer fosfat 0.02 M, pH 7.00 Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Filter glass wool Tambah aseton threefold Istirahatkan 1 jam 60 ml etanol 70 Shaking 250 rpm, 4 jam Sentrifuge 4000xg, 15 menit, 4 o C Residu C 20 ditambahkan reagen Bradford sebanyak 2 ml. Larutan kemudian dihomogenisasi dan diistirahatkan selama 5 menit. Pengukuran dilakukan dengan spektrofotometer pada λ=595 nm. Blanko dibuat dengan cara mencampurkan 100 µl air destilata dengan 2 ml reagen Bradford. Pengukuran sampel dilakukan dengan mengencerkan 10 µl larutan sampel dalam 90 µl buffer fosfat 0,02M; pH 7,0 kemudian ditambahkan dengan 2 ml reagen Bradford. Langkah selanjutnya sama dengan langkah pada pembuatan kurva standar.

6. Penentuan Profil Protein dengan Menggunakan SDS-PAGE Bollag