17 Campuran yang akan dipisah, berupa larutan ditotolkan berupa bercak ataupun
pita, setelah plat atau lapisan dimasukkan ke dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok fase gerak, pemisahan terjadi selama
pengembangan, selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan Stahl, 1985.
Pendeteksian bercak hasil pemisahan dapat dilakukan dengan beberapa cara. Untuk senyawa tak berwarna cara yang paling sederhana adalah dilakukan
pengamatan dengan sinar ultraviolet. Beberapa senyawa organik bersinar atau berfluorosensi jika disinari dengan sinar ultraviolet gelombang pendek 254 nm
atau gelombang panjang 366 nm, jika dengan cara itu senyawa tidak dapat dideteksi maka harus disemprot dengan pereaksi yang membuat bercak tersebut
tampak yaitu pertama tanpa pemanasan, kemudian bila perlu dengan pemanasan Gritter, et al., 1991; Stahl, 1985.
a. Fase diam lapisan penyerap
Fase diam berupa lapisan tipis yang terdiri atas bahan padat yang dilapiskan pada permukaan penyangga datar yang biasanya terbuat dari kaca,
plastik atau logam. Lapisan fase diam melekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat atau amilum Gritter, et al., 1991.
Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensinya
dan resolusinya. Penyerap yang paling sering digunakan adalah silika gel dan serbuk selulosa Gandjar dan Abdul, 2012.
Universitas Sumatera Utara
18
b. Fase gerak pelarut pengembang
Fase gerak ialah medium angkut yang terdiri atas satu atau campuran beberapa pelarut, jika diperlukan sistem pelarut multi komponen, harus berupa
suatu campuran sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen Stahl, 1985.
Pemisahan pada KLT dikendalikan oleh rasio distribusi komponen dalam sistem fase diampenyerap dan fase gerak tertentu. Profil pemisahan pada KLT
dapat dimodifikasi dengan mengubah rasio distribusi dengan mengubah komposisi fase gerak dengan memperhatikan polaritas Gandjar dan Abdul, 2012.
c. Harga Rf
Mengidentifikasi noda-noda dalam kromatogram KLT sangat lazim menggunakan harga Rf Retardation Factor yang didefinisikan sebagai:
Rf = Jarak titik pusat bercak dari titik awal
Jarak garis depan pelarut dari titik awal Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf: a. struktur kimia dari senyawa yang
sedang dipisahkan, b. Sifat penyerap, c. tebal dan kerataan lapisan penyerap, d. pelarut dan derajat kemurniannya, e. derajat kejenuhan uap pengembang dalam
bejana, f. teknik percobaan, g. jumlah cuplikan yang digunakan, h. Suhu dan i. kesetimbangan Sastrohamidjojo, 1985.
2.4.2 Kromatografi kolom
Kromatografi kolom berupa pipa gelas yang dilengkapi dengan kran dan gelas penyaring didalamnya. Ukuran kolom tergantung pada banyaknya zat yang
akan dipisahkan. Untuk menahan penyerap yang diletakkan di dalam kolom dapat digunakan gelas wool atau kapas Sastrohamidjojo, 1985.
Universitas Sumatera Utara
19 Kromatografi kolom biasanya dikembangkan dengan campuran pelarut
yang terus-menerus berubah dengan cara landaian. Eluat yang keluar dari dasar kolom harus dipantau untuk mengetahui dimana linarut itu berada. Ini dapat
dilakukan secara terus-menerus dengan memakai detektor yang cocok atau dengan membagi eluat menjadi sejumlah cuplikan yang berurutan dan menganalisisnya
dengan KLT Gritter, et al., 1991.
2.4.3 Kromatografi lapis tipis preparatif
Kromatografi lapis tipis KLT preparatif merupakan salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah dan menggunakan
peralatan sederhana. Ketebalan penyerap yang sering dipakai adalah 0,5 - 2 mm, ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm. Pembatasan ketebalan lapisan dan
ukuran plat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLT preparatif. Penyerap yang paling umum digunakan adalah silika gel
Hostettmann, et al., 1995. Penotolan cuplikan dilakukan dengan melarutkan cuplikan dalam sedikit
pelarut. Cuplikan ditotolkan berupa pita dengan lebar pita sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan
pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis. Pengembangan plat KLT preparatif dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat.
Bejana dijaga tetap jenuh dengan pelarut pengembang dengan bantuan kertas saring yang tercelup ke dalam pengembang Hostettmann, et al., 1995.
Kebanyakan penyerap KLT preparatif mengandung indikator fluorosensi yang membantu mendeteksi letak pita yang terpisah pada senyawa yang menyerap
sinar ultraviolet. Untuk mendeteksi senyawa yang tidak menyerap sinar ultraviolet
Universitas Sumatera Utara
20 yaitu dengan cara menutup plat dengan sepotong kaca lalu menyemprot kedua sisi
dengan penyemprot Hostettmann, et al., 1995.
2.4.4 Kromatografi lapis tipis dua arah two-dimensional TLC
KLT dua arah atau KLT dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mempunyai karakteristik kimia
yang hampir sama, karena nilai Rf juga hampir sama. Selain itu, dua sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran
tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang hampir sama. Dengan demikian maka KLT dua
dimensi dapat dipakai untuk memeriksa kemurnian isolat Rohman, 2009. KLT dua dimensi dilakukan dengan melakukan penotolan sampel disalah
satu sudut lapisan lempeng tipis dan mengembangkannya sebagaimana biasa dengan fase gerak pertama. Lempeng kromatografi selanjutnya dipindahkan dari
chamber pengembang dan eluen dibiarkan menguap dari lempeng. Lempeng dimasukkan ke dalam chamber yang menggunakan eluen kedua sehingga
pengembangan dapat terjadi pada arah kedua yang tegak lurus dengan arah pengembangan yang pertama. Suksesnya pemisahan tergantung pada kemampuan
untuk memodifikasi selektifitas eluen kedua dibandingkan dengan selektifitas eluen pertama Rohman, 2009.
2.5 Spektrofotometri
