29
BAB III METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Fitokimia Dakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara meliputi pengumpulan dan pengolahan bahan tanaman, skrining fitokimia, pemeriksaan karakterisasi simplisa, pembuatan
ekstrak etanol daun ingul dan fraksinasi dengan pelarut n-heksana dan etilasetat. Pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar dengan cakram kertas
terhadap Eschericia coli, Salmonella typhi dan Bacillus subtilis.
3.1 Alat- alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, aluminium foil, alat tanur, benang wol, blender Philips, cakram kertas, cawan
petri, inkubator Fiber Scientific, jangka sorong, jarum ose, kaca objek, kapas, kasa,Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF I200L, lampu bunsen, lemari
pendingin Toshiba, lemari pengering, mikro pipet Eppendorf,mikroskop, neraca analitik Mettler Toledo, neraca kasar Ohanus,otoklaf Fisons, oven
Memmert, pinsetdan rotary evaporator Haake D.
3.2 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah air suling, etanol 80, daun ingulToona sinensis Juss. M. Roem, nutrient agar Merck, nutrient
broth Merck dan bahan- bahan yang berkualitas proanalisa: α-naftol, amil
alkohol, asam nitrat pekat, asam asetat anhidrat, asam klorida pekat, asam sulfat
Universitas Sumatera Utara
30
pekat, benzena, besi III klorida, bismuth nitrat, dimetilsulfoksida DMSO, etilasetat, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloroform, metanol, natrium
hidroksida, natrium klorida, n-heksana, raksa II klorida, serbuk magnesium, timbal II asetatdan toluena. Bakteri yang digunakan adalah bakteri Escherichia
coliATCC 10536, Salmonella typhiATCC 19943 dan Bacillus subtilis.
3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi dan Media 3.3.1 Pembuatan larutan pereaksi
3.3.1.1 Pereaksi Mayer
Sebanyak 2,266 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml dan pada wadah lain dilarutkan 50 g kalium iodida dalam 100 ml air suling. 60
ml larutan I dicampurkan dengan 10 ml larutan II dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.3.1.2 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,001 g natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.3.1.3 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml, lalu disaring Ditjen, POM., 1979.
3.3.1.4Pereaksi asam klorida 2 N
Asam klorida pekat sebanyak 16,6 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen, POM., 1979.
3.3.1.5 Pereaksi Dragendorff
Pereaksi dibuat dua larutan persediaan : 1 0,6 g bismut nitrat dalam 2 ml HCl pekat dan 10 ml air; 2 6 g kalium iodida dalam 10 ml air.
Universitas Sumatera Utara
31
Larutan persediaan ini dicampur dengan 7 ml HCl pekat dan 15 ml air Harborne, 1987.
3.3.1.6 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dan 2 g iodium dilarutkan dalam air suling secukupnya hingga 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.3.1.7 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida hingga 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.3.1.8 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 5 ml asam sulfat pekat kemudian ditambahkan etanol hingga volume 50 mlDepkes, RI.,
1995
3.3.1.9 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 g alfa naftol dilarutkan dalam 15 ml etanol 95 ditambahkan dengan asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen,
POM., 1995.
3.3.1.10 Pereaksi kloralhidrat
Larutan kloralhidrat dibuat dengan cara melarutkan kloralhidrat sebanyak 50 g dalam 20 ml air Ditjen, POM., 1995.
3.3.2 Pembuatan media 3.3.2.1 Media nutrient agar
Komposisi : Pepton from meat 5,0 g
Meat extract 3,0 g
Agar-agar 12,0 g
Air suling ad 1 L
Universitas Sumatera Utara
32
Cara pembuatan: Sebanyak 20 g nutrient agar ditimbang, disuspensikan ke dalam air suling
sebanyak 1000 ml, lalu dipanaskan sampai bahan larut sempurna lalu disterilkan di dalam otoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Merck, 2005.
3.3.2.2 Media nutrient broth
Komposisi : Peptone 5,0 g
meat extract 3,0 g Air suling ad 1 L
Cara pembuatan: Sebanyak 8 g serbuk nutrient broth dilarutkan dalam air suling steril
sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 L dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna, kemudian disterilkan di otoklaf
pada suhu 121
o
C selama 15 menit Merck, 2005.
3.3.2.3 Pembuatan agar miring
Sebanyak 3 ml media nutrient agar cair, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diletakkan pada sudut kemiringan 30
o
-45
o
dan dibiarkan memadat, kemudian disimpan di lemari pendingin Lay, 1994.
3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini disterilkan lebih dahulu sebelum dipakai. Media pertumbuhan disterilkan di
otoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit dan alat- alat gelas disterilkan di oven pada suhu 160-170
o
C selama 1-2 jam. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan cara dibakar dengan nyala bunsen Lay, 1994.
Universitas Sumatera Utara
33
3.5 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tanaman 3.5.1 Pengumpulan bahan tanaman
Pengambilan bahan tanaman dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan tanaman yang sama dengan daerah lain. Bahan tanaman yang
digunakan adalah daun ingul. Bahan diambil dari Desa Semangat, Kecamatan Tiga Panah, Kabupaten Karo, Provinsi Sumatera Utara.
3.5.2 Identifikasi tanaman
Identifikasi tanaman dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian - Biologi LIPI Bogor. Hasil identifikasi dapat dilihat pada
Lampiran 1 halaman 55.
3.5.3 Pembuatan simplisia
Daun ingul dicuci bersih dari pengotoran dengan air sampai bersih dan ditiriskan. Kemudian dikeringkan di lemari pengering dengan suhu 40
o
- 50
o
C. Daun ingul dianggap kering apabila sudah rapuh diremas menjadi hancur,
kemudian simplisia daun ingul yang telah kering diserbuk menggunakan blender, dan disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat. Gambar simplisia dan
serbuk simplisia dapat dilihat pada Lampiran 2 halaman 58.
3.6 Karakterisasi Simplisia 3.6.1 Pemeriksaan makroskopik
Kategori