25,81 ± 0,314 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis Tabel VI.
H. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan
Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman Koleva, et
al., 2002; Prakash, et al., 2010. DPPH merupakan radikal bebas yang dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen. Keberadaan
senyawa beraktivitas antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. DPPH mempunyai maksimum pada 517 nm Dehpour, et al.,
2009. Oleh karena itu, peneliti melakukan scanning maksimum pada pelarut,
fraksi etil asetat, dan rutin pada daerah 400-600 nm Lampiran 11. Hal ini dilakukan dengan tujuan memastikan bahwa tidak ada gangguan pengukuran pada
daerah maksimum DPPH yang dapat menyebabkan hasil pengukuran absorbansi dari DPPH menjadi tidak akurat. Hasil tersebut tidak menunjukkan adanya
gangguan pada daerah maksimum DPPH. Setelah dipastikan tidak terdapat gangguan maka metode DPPH dapat dilaksanakan untuk menguji aktivitas
antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis. Untuk menguji aktivitas antioksidan perlu dilakukan terlebih dahulu proses optimasi metode
DPPH. Proses optimasi tersebut berupa penentuan OT dan scanning maksimum
DPPH.
1 Penentuan maksimum metode uji aktivitas antioksidan
Tujuan penentuan maksimum adalah untuk menetapkan panjang gelombang DPPH yang digunakan dalam penelitian ini. Pengukuran absorbansi
perlu dilakukan pada maksimum karena pada maksimum, dengan hanya sedikit perubahan konsentrasi akan memberikan perubahan absorbansi yang besar
sehingga didapatkan sensitivitas analisis yang maksimum. Selain itu, kurva pada maksimum relatif datar sehingga adanya sedikit
pergeseran panjang gelombang karena variasi instrumental, absorbansi tetap stabil.
Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH
Penentuan maksimum dilakukan dengan scanning terhadap tiga seri konsentrasi larutan DPPH pada panjang gelombang visibel dari 400 nm sampai
600 nm. DPPH bisa terukur pada daerah visibel karena memiliki gugus kromofor dan auksokrom gambar 8, sedangkan dengan adanya elektron yang tidak
berpasangan, DPPH memberikan serapan kuat pada 517 nm yang menyebabkan larutan DPPH berwarna ungu. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh
keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun dan larutan menjadi berwarna kuning. Pemilihan rentang panjang gelombang 400-600 nm
didasarkan pada warn a DPPH berupa ungu dan maksimum-nya pada 517 nm.
Dari ketiga seri larutan DPPH tersebut, dipero leh maksimum, yaitu pada 515
nm.
2 Penentuan OT metode uji aktivitas antioksidan
Tujuan penentuan OT adalah untuk menetapkan rentang waktu dimana larutan pembanding dan uji sudah mereduksi radikal DPPH dengan sempurna
sehingga diperoleh nilai absorbansi yang stabil. Jika nilai absorbansi stabil maka pengukuran bisa reprodusibel dan meminimalkan kesalahan analisis. Penentuan
OT dilakukan dengan mengukur absorbansi DPPH pada maksimum DPPH yang
telah diukur sebelumnya, yaitu 515 nm setiap 5 menit selama 60 menit pada larutan pembanding dan uji.
Gambar 10. Grafik penentuan OT larutan rutin
Gambar 11. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat
Hasil penentuan OT terlihat pada gambar 10 dan 11, yaitu pada menit ke- 5 sampai ke-60 baik pada larutan pembanding maupun uji, absorbansi DPPH
memberikan nilai yang semakin stabil, hal ini menunjukkan bahwa reaksi antara DPPH dengan senyawa antioksidan dalam larutan pembanding dan uji semakin
sempurna dan akhirnya berhenti. Dari gambar 10 dan 11, dapat dinyatakan bahwa OT pada larutan pembanding rutin selama 55 menit, sedangkan pada larutan uji
fraksi etil asetat selama 45 menit.
I. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan
Validasi metode analisis adalah suatu penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan di laboratorium, untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk digunakan Harmita, 2004.
Untuk mengetahui validitas metode uji aktivitas antioksidan dilakukan analisis presisi, linearitas, dan spesifisitas terhadap replikasi uji aktivitas
antioksidan rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis. Tiga persamaan regresi linear antara konsentrasi rutin dan fraksi etil
asetat dengan IC telah dibuat. Dari ketiga persamaan tersebut dipilih persamaan yang paling linear yang ditunjukkan oleh nilai r nya. Persamaan regresi linear
yang paling baik untuk rutin diperoleh dari replikasi tiga y = 1,7697x + 5,8873; dengan 0,996 sebagai nilai r, sedangkan untuk fraksi etil asetat diperoleh dari
replikasi dua y = 0,167x + 1,194; dengan 0,996 sebagai nilai r. Persamaan tersebut digunakan untuk menghitung konsentrasi terukur baik untuk rutin
maupun larutan uji. Hasil CV dapat dihitung jika konsentrasi tersebut telah didapatkan. Gambar 12 dan 13 menunjukkan kurva persamaan regresi linear
aktivitas antioksidan rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis.
Gambar 12. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan rutin
y = 1,769x + 5,887 r = 0,996
0,00 20,00
40,00 60,00
80,00 100,00
10 20
30 40
50
A x
is T
it le
Axis Title
Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan rutin
Gambar 13. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik kulit jeruk manis
Dari gambar 12 dan 13, tampak bahwa ada korelasi antara konsentrasi rutin dan fraksi etil asetat dengan IC yang ditunjukkan dari koefisien korelasi
grafik nilai r yang mendekati nilai satu. Koefisien korelasi tersebut bernilai positif yang menunjukkan bahwa hubungan antara konsentrasi baik rutin maupun
fraksi etil asetat dengan IC yang dihasilkan sebanding. Semakin besar konsentrasi dari rutin maupun fraksi etil asetat maka semakin besar IC yang
dihasilkan, begitu juga sebaliknya.
1 Presisi metode uji aktivitas antioksidan
Presisi suatu metode analisis dinyatakan dalam persentase Coefficient of Variation CV.
10 20
30 40
50 60
70 80
100 200
300 400
500
IC
Konsentrasi µgmL
Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan fraksi etil asetat
y = 0,167x + 1,194 r = 0,996
Tabel VII. Hasil presisi aktivitas antioksidan standar rutin Konsentrasi
µgmL Rata-rata
konsentrasi µgmL
SD CV
12,25 11,64
0,425 3,651
19,25 19,57
0,739 3,778
26,25 27,63
0,525 1,899
33,25 34,18
0,697 2,038
40,25 39,49
0,151 0,383
Nilai CV untuk larutan pembanding rutin pada tabel diatas berada pada rentang 0,383 - 3,778. N
ilai presisi yang masih dapat diterima adalah ≤ 5 Harmita, 2004. Pada semua seri konsentrasi larutan pembanding rutin telah
memenuhi nilai presisi yang baik.
Tabel VIII. Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat Konsentrasi
µgmL Rata-rata
konsentrasi µgmL
SD CV
160 164,803
0,516 0,313
232,5 233,176
0,504 0,216
305 292,33
0,207 0,071
377,5 395,38
0,518 0,131
450 446,6
0,744 0,166
Nilai CV untuk larutan uji pada tabel diatas berada pada rentang 0,071 - 0,313. N
ilai presisi yang masih dapat diterima adalah ≤ 5 Harmita, 2004. Pada semua seri konsentrasi larutan uji diketahui telah memenuhi nilai
presisi yang baik. Dari hasil tersebut, dapat dikatakan bahwa metode DPPH yang digunakan memiliki presisi yang baik.
2 Linearitas metode uji aktivitas antioksidan
Linearitas suatu metode didasarkan pada nilai koefisien korelasi r yang dihasilkan dari suatu persamaan regresi linier. Linearitasnya dikatakan semakin
baik apabila nilai r semakin mendekati satu. Nilai koefisien korelasi r untuk larutan pembanding rutin untuk replikasi I = 0,9957; replikasi II = 0,9953; dan
replikasi III = 0,99649 Tabel VI. Data linearitas dapat diterima jika memenuhi nilai r 0,995 Chan, Lam, Herman, Lee, 2005. Dari hasil tersebut, persamaan
kurva baku untuk ketiga replikasi larutan pembanding rutin telah memenuhi persyaratan lineraitas yang baik.
Tabel IX. Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH
Replikasi Konsentrasi
µgmL IC
Persamaan regresi linier
11,53 26,30
18,77 39,12
I 27,29
54,20 y = 1,5296x + 14,693
34,92 67,69
r = 0,9957 39,66
76,08 12,11
27,31 20,23
41,69 II
28,23 55,85
y = 1,7238x + 7,8707 34,09
66,22 r = 0,9953
39,45 75,70
11,27 25,84
19,72 40,79
III 27,36
54,35 y = 1,7697x + 5,8873
33,54 65,24
r = 0,99649 39,36
75,55
Tabel X. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis dengan metode DPPH
Replikasi Konsentrasi µgmL
IC Persamaan regresi linier
160 28,90
y = 0,166x + 1,581 r = 0,995
232,5 40,38
I 305
49,94 377,5
67,04 450
76,04 160
28,57 y = 0,167x + 1,194
r = 0,996 232,5
40,04 II
305 50,05
377,5 67,37
450 75,70
160 28,68
y = 0,167x + 1,377 r = 0,995
232,5 40,15
III 305
50,05 377,5
67,26 450
75,59
Hasil dari persamaan regresi linier hasil dari tiga replikasi fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis yang ditunjukan pada tabel X, didapatkan
persamaan regresi linear berturut-turut adalah replikasi satu r = 0,995; r = 0,996, dan r = 0,995. Tiga hasil ini masih memenuhi nilai koefisien korelasi linearitas
minimal menurut Chan, et al. 2005, yaitu r 0,995. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan metode ini memiliki linearitas yang baik untuk menganalisis fraksi
etil asetat ekstrak kulit jeruk manis.
3 Spesifitas metode uji aktivitas antioksidan
Spesifitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang
mungkin ada dalam matriks sampel Harmita, 2004. Dalam metode analisis ini yang menggunakan spektrofotometri visibel pada pengukuran rutin dan fraksi etil
asetat ekstrak etanol sampel uji, spesifikasi metode dapat dilihat dengan tidak
adanya serapan dari sampel sebelum ditambah DPPH pada panjang gelombang pengukuran yang digunakan, yaitu 515 nm. Dari hasil spektra terlihat bahwa
larutan rutin, larutan uji fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis dan pelarut metanol tidak menunjukkan adanya gangguan berarti terhadap absorbansi
DPPH hasil reaksi Lampiran 11. Dengan demikian dapat dikatakan metode ini memilki spesifitas yang baik.
Dari hasil validasi metode analisis yang dilakukan menunjukkan bahwa metode penangkapan radikal bebas DPPH oleh rutin dan fraksi etil asetat ekstrak
etanol kulit jeruk manis sebagai antioksidan terbukti sudah baik dalam, presisi, spesifisitas dan linearitas sehingga hasil yang diperoleh dapat dipercaya.
J. Hasil Penentuan Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH
Kategori