BAB IV METODOLOGI PENELITIAN
4.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Farmaseutika Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam
Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta, Laboratorium Farmasi Angkatan Laut Jakarta, Laboratorium Makmal Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia, dan Laboratorium Sediaan Padat Fakultas Farmasi Universitas Pancasila. Penelitian ini dilakukan dari bulan Mei sampai bulan Agustus
2010.
4.2 Alat dan Bahan
4.2.1 Alat Penelitian
Alat yang digunakan adalah alat pencetak tablet, desikator, hardness tester
, friabilator, moisture content balance, sieving analyzer, neraca analitik, jangka sorong, rotary evaporator, erlenmeyer, stop watch,
cawan porselen, corong, statif, krus platina, penggiling blender, batang pengaduk, kapas steril, oven, vortex, lemari pendingin, Sysmex Pouch
100i, FACSCalibur, serta peralatan steril yang lazim digunakan di laboratorium.
4.2.2 Bahan Penelitian Simplisia
Simplisia yang digunakan adalah bongkahan gambir yang merupakan ekstrak air daun dan ranting dari tanaman gambir Uncaria gambir Roxb
Bahan Kimia dan Pereaksi
Bahan pelarut untuk ekstraksi adalah etanol 70. Bahan untuk penapisan fitokimia adalah ammonia 10, 25, kloroform,
HCl 1, 1:10, pereaksi Dragendorff, pereaksi Mayer, aquadest, lempeng magnesium, HCl pekat, butanol, larutan besi III klorida FeCl
3
1, pereaksi Stiasny, NaOH 1 N, eter, asam asetat anhidrat, H
2
SO
4
pekat, pereaksi Libermann-Burchard, petroleum eter.
Bahan untuk pembuatan tablet hisap adalah polyvinylpyrrolidone, sukralosa, dekstrosa, laktosa, talkum, Mg stearat, aerosil, kristal mentol,
pewarna coklat. Bahan untuk uji CD4 adalah reagen BD Tritest CD4, lysing solution
4.3 Prosedur Penelitian
4.3.1 Penyiapan Bahan yang Digunakan
Sampel yang digunakan adalah Gambir Uncaria gambir Roxb yang diambil dari tanaman gambir, yang terdapat di daerah Padang,
Sumatera Barat. Daun dan ranting dikumpulkan dan dibersihkan dari
kotoran yang melekat dengan air bersih mengalir, lalu ditiriskan agar terbebas dari sisa air cucian kemudian dikeringkan pada suhu kamar.
Simplisia yang sudah kering kemudian digiling dan diayak dengan ayakan untuk mendapatkan serbuk, lalu simplisia disimpan pada wadah
yang kering dan tertutup rapat, serta dalam ruangan yang terlindung dari cahaya Depkes RI, 1986
4.3.2 Pembuatan Ekstrak Etanol Gambir
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan metode maserasi. Sebanyak 500 gram serbuk kering gambir Uncaria gambir Roxb dimaserasi
dengan pelarut etanol 70 dan dilakukan pengocokan sesekali. Proses tersebut dilakukan selama 1-2 minggu dimana sekali dalam 2 hari pelarut
diganti dan disaring. Proses tersebut dilakukan hingga filtrat mendekati tidak berwarna. Semua filtrat digabung, dan diuapkan atau dipekatkan
dengan rotary evaporator pada suhu 40-50°C hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental dikeringkan dengan oven pada suhu 30- 40ºC
sampai kering. Dihitung hasil rendemen ekstrak dengan rumus: Bobot ekstrak yang didapat
Rendemen = x 100
Bobot serbuk simplisia yang diekstraksi
4.3.3 Pengujian Parameter Spesifik dan Non Spesifik Simplisia dan
Ekstrak Depkes RI, 2000
1. Parameter spesifik terdiri dari :
c. Identitas
Parameter identitas ekstrak terdiri dari :
3 Deskripsi tata nama yaitu nama ekstrak generik, dagang,
paten, nama latin tumbuhan sistematika botani, dan bagian tumbuhan yang digunakan.
4 Ekstrak dapat mempunyai senyawa identitas artinya senyawa
tertentu yang menjadi petunjuk spesifik dengan metode tertentu.
d. Organoleptik
Parameter ini mendeskripsikan bentuk, warna, bau, dan rasa. 2.
Parameter non spesifik terdiri dari: a.
Susut Pengeringan dan Kadar Air Ekstrak atau simplisia ditimbang dengan seksama sebanyak 1 gram
sampai 2 gram dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105
o
C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang, ekstrak
diratakan dalam botol timbang dengan menggoyang-goyangkan botol, hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai
10 mm, kemudian dimasukan ke dalam oven, buka tutupnya. Pengeringan dilakukan pada suhu penetapan yaitu 105
o
C hingga diperoleh bobot tetap lalu ditimbang. Sebelum setiap pengeringan,
botol dibiarkan dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar.
b. Kadar Abu
Sebanyak lebih kurang 1-2 gram ekstrak atau simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama, dimasukan ke dalam krus platina
atau krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara. Ekstrak atau simplisia diratakan kemudian dipijarkan perlahan-lahan hingga
arang habis, didinginkan, dan ditimbang. Jika arang tidak dapat hilang, ditambahkan air panas, disaring dengan menggunakan
kertas saring bebas abu. Sisa abu dan kertas saring lalu dipijarkan dalam krus yang sama. Filtrat dimasukkan ke dalam krus,
diuapkan, dipijarkan hingga bobot tetap, ditimbang. Kadar abu dihitung terhadap berat ekstrak dan dinyatakan dalam bb.
c. Kadar abu tidak larut asam: Abu yang diperoleh pada penetapan
kadar abu, didihkan dengan 25 ml HCl encer selama 5 menit, dikumpulkan bagian yang tidak larut dalam asam, disaring melalui
krus kaca masir atau kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan hingga bobot tetap dan ditimbang. Dihitung kadar abu
yang tidak larut dalam asam terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
4.3.4 Identifikasi Serbuk Gambir
Identifikasi serbuk daun gambir Anonim,1989: a.
Pada 2 mg serbuk daun gambir ditambahkan 5 tetes asam sulfat P; terjadi warna coklat merah
b. Pada 2 mg serbuk daun gambir ditambahkan 5 tetes asam sulfat 10 N;
terjadi warna coklat muda c.
Pada 2 mg serbuk daun gambir ditambahkan 5 tetes larutan natrium hidroksida P 5 bv dalam etanol; terjadi warna coklat merah
d. Pada 2 mg serbuk daun gambir ditambahkan 5 tetes ammonia 25 P;
terjadi warna coklat merah e.
Pada 2 mg serbuk daun gambir ditambahkan 5 tetes larutan besi III klorida P 5 bv; terjadi warna coklat kehitaman
4.3.5 Penapisan Fitokimia Farnsworth, 1966
a. Identifikasi Golongan Alkaloid
Sebanyak 2 gram sampel ditambahkan dengan 5 ml ammonia 25, digerus dalam mortir, kemudian ditambahkan 10 ml kloroform dan
digerus kembali dengan kuat, campuran tersebut disaring dengan kertas saring. Filtrat berupa larutan organik diambil sebagai larutan
A, sebagian dari larutan A 10 ml diekstraksi dengan 10 ml larutan HCl 1:10 dengan pengocokan dalam tabung reaksi, diambil larutan
bagian atasnya larutan B. Larutan A diteteskan beberapa tetes pada kertas saring dan ditetesi dengan pereaksi Dragendorff. Jika terbentuk
warna merah atau jingga pada kertas saring maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid dalam sampel.
Larutan B dibagi dalam dua tabung reaksi, ditambahkan masing- masing pereaksi Dragendorff dan Mayer. Jika terbentuk endapan
merah bata dengan pereaksi Dragendorff dan endapan putih dengan pereaksi Mayer maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan
alkaloid.
b. Identifikasi Golongan Flavonoid
Sebanyak 1 gram sampel ditambahkan 50 ml air panas, dididihkan selama 5 menit, disaring dengan kertas saring, diperoleh filtrat yang
akan digunakan sebagai larutan percobaan. Ke dalam 5 ml larutan percobaan dalam tabung reaksi ditambahkan serbuk atau lempeng
magnesium secukupnya dan 1 ml HCl pekat, serta 5 ml butanol, dikocok dengan kuat lalu dibiarkan hingga memisah. Jika terbentuk
warna pada lapisan butanol lapisan atas maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan flavonoid.
c. Identifikasi Golongan Saponin
Sebanyak 10 ml larutan percobaan yang diperoleh dari percobaan b identifikasi golongan flavonoid, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
dan dikocok secara vertikal selama 10 detik, kemudian dibiarkan selama 10 menit. Jika dalam tabung reaksi terbentuk busa yang stabil
dan jika ditambahkan 1 tetes HCl 1 busa tetap stabil maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan saponin.
d. Identifikasi Golongan Tanin
Sejumlah 2 gram sampel ditambahkan 100 ml air, dididihkan selama 15 menit lalu didinginkan dan disaring dengan kertas saring, filtrat
yang diperoleh dibagi menjadi dua bagian. Ke dalam filtrat pertama ditambahkan 10 ml larutan FeCl
3
1, jika terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman maka hal itu menunjukkan adanya senyawa
golongan tanin.
Ke dalam filtrat yang kedua ditambahkan 15 ml pereaksi Stiasny formaldehid 30 : HCl pekat = 2 : 1, lalu dipanaskan di atas
penangas air sambil digoyang-goyangkan. Jika terbentuk endapan warna merah muda menunjukkan adanya tanin katekuat. Selanjutnya
endapan disaring, filtrat dijenuhkan dengan serbuk natrium asetat, ditambahkan beberapa tetes larutan FeCl
3
1, jika terbentuk warna biru tinta maka menunjukkan adanya tanin galat.
e. Identifikasi Golongan Kuinon
Diambil 5 ml larutan percobaan dari percobaan b identifikasi golongan flavonoid, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
ditambahkan beberapa tetes larutan NaOH 1 N. Jika terbentuk warna merah maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan kuinon.
f. Identifikasi Golongan Steroid dan Triterpenoid
Sebanyak 1 gram sampel ditambahkan dengan 20 ml eter, dibiarkan selama 2 jam dalam wadah dengan penutup rapat lalu disaring dan
diambil filtratnya. 5 ml dari filtrat tersebut diuapkan dalam cawan penguap hingga diperoleh residua tau sisa. Ke dalam residu
ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Libermann-Burchard. Jika terbentuk warna hijau atau merah
maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan steroid dan triterpenoid dalam simplisia tersebut.
g. Identifikasi Golongan Minyak Atsiri
Sejumlah 2 gram sampel dalam tabung reaksi volume 20 ml, ditambahkan 10 ml pelarut petroleum eter dan dipasang corong yang
diberi lapisan kapas yang telah dibasahi dengan air pada mulut tabung, dipanaskan selama 10 menit di atas penangas air dan
didinginkan lalu disaring dengan kertas saring. Filtrat yang diperoleh diuapkan dalam cawan penguap hingga diperoleh residu. Residu
dilarutkan dengan pelarut alkohol sebanyak 5 ml lalu disaring dengan kertas saring. Filtratnya diuapkan dalam cawan penguap, jika residu
berbau aromatic atau menyenangkan maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan minyak atsiri.
h. Identifikasi Golongan Kumarin
Sebanyak 2 gram sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi volume 20 ml, ditambahkan 10 ml pelarut kloroform dan dipasang corong
yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi dengan air pada mulut tabung, dipanaskan selama 10 menit di atas penangas air dan
didinginkan lalu disaring dengan kertas saring. Filtrat yang diperoleh diuapkan dalam cawan penguap hingga diperoleh residu. Residu
ditambahkan air panas sebanyak 10 ml lalu didinginkan. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 0,5 ml
larutan ammonia NH
4
OH 10. Lalu diamati di bawah sinar lampu ultraviolet pada panjang gelombang 365 nm. Jika terjadi fluoresensi
warna biru atau hijau maka hal itu menunjukkan adanya senyawa golongan kumarin.
i. Identifikasi Urea Depkes RI, 1995
1 Sebanyak 500 mg sampel dipanaskan dalam tabung kimia hingga
meleleh dan bau ammonia. Pemanasan dilakukan hingga cairan
keruh lalu dinginkan dan larutkan dalam campuran 10 ml air dan 0,5 ml larutan Natrium hidroksida P, Ditambahkan 1 tetes larutan
tembaga III sulfat P; terjadi perubahan warna violet 2
Sebanyak 100 mg sampel dilarutkan dalam 1 ml air, ditambahkan 1 ml asam nitrat P; terbentuk endapan hablur putih.
4.4 Formulasi Tablet Hisap
a. Formula Tablet Hisap Ekstrak Etanol Gambir Uncaria gambir
Roxb Tabel 4.
Formula Tablet Hisap Ekstrak Etanol Gambir
Bahan Variasi Konsentrasi
A B
C
Ekstrak gambir 500 mg
500 mg 500 mg
PVP 200 mg
320 mg 400 mg
Sukralosa 10 mg
10 mg 10mg
Dekstrosa 2788 mg
2658 mg 2568 mg
Laktosa 400 mg
400 mg 400 mg
Mg stearat 40 mg
40 mg 40 mg
Talk 40 mg
40 mg 40 mg
Aerosil 20 mg
20 mg 20 mg
Serbuk mentol -
10 mg 20 mg
Pewarna coklat 2 mg
2 mg 2 mg
b. Pembuatan Tablet
Tiap bahan yang telah ditimbang dimasukkan satu per satu ke dalam wadah dan kemudian dicampur hingga homogen. Campuran serbuk
tersebut kemudian dilakukan evaluasi granul berdasarkan literatur kemudian dicetak menjadi tablet jadi dalam mesin tablet dengan
metode kempa langsung. Tablet yang dihasilkan kemudian diuji sesuai persyaratan.
4.4.1 Evaluasi Granul
a. Kadar air Voight, 1994
Sebanyak 1 gram granul dimasukkan ke dalam alat moisture balance. Granul diratakan dan kemudian alat dijalankan, selanjutnya diperoleh
data kadar air yang terkandung dalam granul. Syarat : 2 – 5
b. Kompresibilitas Aulton, 1988; Voight, 1994
Granul ditimbang sebanyak 100 gram kemudian dimasukkan ke dalam gelas ukur 100 ml dan dicatat volumenya V
. Granul tersebut kemudian diketuk-ketukkan sebanyak 500 kali dan dicatat kembali
volume setelah pengetukan V
1
. Data yang diperoleh dimasukkan ke dalam rumus :
kompresibilitas = V
– V
1
x 100
V Syarat : 5 – 15
c. Distribusi Ukuran Partikel Voight, 1994
Masing-masing ayakan pada sieving analyzer disusun berturut-turut mulai dari yang teratas adalah mesh 12, 14, 16, 18, 20 dan 22.
Kemudian granul dimasukkan ke dalam alat sieving analyzer. Alat dihidupkan, kemudian granul yang didapat pada masing-masing
ayakan ditimbang lalu dihitung persen bobot granul pada masing- masing ayakan dan dibuat kurva antara persen bobot granul sumbu y
dengan ukuran ayakan sumbu x Syarat : distribusi ukuran partikel sisa 10
d. Laju alir Lachman, 1994; Aulton, 1988
25 gram granul ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam corong yang tertutup dan diratakan. Kemudian penutup corong dibuka dan
dicatat waktu yang diperlukan seluruh granul habis melewati corong. Syarat : 10 gramdetik
e. Sudut henti Voight, 1994; Aulton, 1988
Dihitung diameter dan tinggi kerucut yang terbentuk pada gundukan granul pada uji laju alir, kemudian dicari besar sudut henti dengan
rumus : tan α = 2h
d dimana : h = tinggi kerucut gundukan granul
d = diameter gundukan granul Syarat : 25 – 30
o
4.4.2 Evaluasi Tablet
a. Pemeriksaan organoleptik
Tablet yang dihasilkan dinilai secara keseluruhan baik bentuknya maupun warna, aroma dan rasanya
b. Keseragaman bobot Depkes RI, 1979
Masing-masing ditimbang sebanyak 20 tablet yang diambil secara acak, kemudian dihitung bobot rata-rata tiap tablet
Syarat : bila bobot rata-rata lebih dari 300 mg, jika ditimbang satu per satu tidak lebih dari 2 buah tablet yang masing-masing bobotnya
menyimpang 5 dari bobot rata-ratanya, dan tidak ada satu pun tablet yang bobotnya menyimpang lebih dari 10 dari bobot rata-ratanya.
c. Keseragaman ukuran Depkes RI, 1979; Gatiningsih, 2008
Diambil secara acak sebanyak 20 buah tablet, diukur diameter dan tebal tablet dengan menggunakan jangka sorong.
Syarat : 18 mm d.
Friabilitas Lachman, 1994 Ditimbang sebanyak 20 buah tablet yang diambil secara acak dan
dibersihkan dari debu. Kemudian diletakkan dalam alat friabilator dan alat dijalankan sebanyak 100 putaran dengan kecepatan 25 rpm.
Syarat : kehilangan berat 1 e.
Kekerasan Ansel, 1989; Parrot, 1971 Diambil sebanyak 20 tablet secara acak kemudian ditentukan
kekerasannya dengan alat hardness tester. Pada umumnya kekerasan tablet hisap lebih tinggi dibandingkan dengan tablet biasa.
Syarat : 10 – 20 kgcm
2
f. Waktu hancur Lachman, 1994
Tablet hisap dirancang agar tidak mengalami kehancuran di dalam mulut, tetapi larut atau terkikis secara perlahan-lahan dalam jangka
waktu 30 menit atau kurang.
4.5 Uji Kesukaan
Uji kesukaan dilakukan terhadap ketiga formula tablet hisap pada 20 orang responden dewasa baik laki-laki maupun perempuan yang diminta untuk
memberikan penilaian dalam hal rasa dan aroma tablet hisap. Penilaian dilakukan dengan cara mengisi kuesioner untuk mengetahui tingkat
kesukaan terhadap rasa dan aroma dari masing-masing formula tablet hisap dengan mengikuti instruksi yang terdapat pada kuesioner.
4.6 Uji CD4
a. Perencanaan konsentrasi ekstrak uji
Pada penelitian sebelumnya mengenai Uji Efek Imunomodulator Ekstrak Etanol Gambir Uncaria gambir Roxb Terhadap Aktivitas dan
Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag Peritonium Mencit Secara In Vivo, efek imunomodulator terus meningkat pada dosis 400 mgkg
BB, sehingga perlu dilakukan pengujian efek imunomodulator terhadap manusia, dengan menggunakan konversi dosis. Dari
perhitungan diperoleh bahwa dosis yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebesar 2000 mg. Amalia, 2009
b. Pengambilan sampel darah
Pengambilan darah dilakukan di Laboratorium Makmal Terpadu Universitas Indonesia. Tiap responden masing-masing diambil
darahnya sebanyak 3 ml, dengan jumlah responden sebanyak 8 orang dengan 1 orang kontrol positif yang mengkonsumsi tablet IM®, 1
orang kontrol negatif yang tidak diberi perlakuan, dan 6 orang yang diberi tablet hisap ekstrak gambir. Penentuan jumlah sampel ini
ditentukan menurut rumus Federer Adimunca,2010 : T n-1 15
Dimana : T = jumlah perlakuan n = jumlah pengulangan
c. Perlakuan terhadap sampel darah
Sampel darah yang telah diambil dari responden segera diukur kadar limfositnya dengan alat Sysmex Pouch 100i. Sebanyak 50 µl sampel
darah dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup dan ditambahkan reagen BD Tritest™ sebanyak 20 µl sambil tabung digoyangkan secara
perlahan. Tabung reaksi tersebut kemudian diinkubasikan di ruang gelap selama 15 menit pada suhu ruangan, dan ditambahkan 450 µl
lysing solution ke dalamnya. Tabung reaksi berisi sampel tersebut
kemudian diinkubasikan untuk kedua kalinya di lemari pendingin pada suhu 4
o
C selama 15 menit, dan selanjutnya dimasukkan ke alat FACSCalibur dan diperoleh nilai CD4 dalam darah.
4.7 Analisa Data
Kategori