200dan fasa gerak campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 vv, 80:20 vv, 70:30 vv, 60:40 vv. Tahapan Isolasi kolom kromatografi dilakukan dengan cara
kering dimana kolom kromatografi yang telah dirangkai dan dilengkapi kapas pada batas bawah, dimasukkan pelarut n-heksan 100 hingga ¾ volume kolom yang digunakan.
Dimasukkan silika gel 50 g dengan perlahan-lahan, dielusi dengan pelarut n-heksan hingga padatan silika gel didalam kolom merata dan bebas gelembung udara. Ditambahkan kapas
pada lapisan atas silika gel sebagai bidang batas sampel dengan silika gel. Dimasukkan 1,3 g ekstrak pekat klorofom daun tumbuhan Ingul ke dalam kolom kromatografi yang telah
dicampurkan silika gel 10 g, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat90 : 10 vv secara perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama
banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n – heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20 vv, 70:30 vv,
60:40 vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 ml .
3.3.8 Penggabungan Fraksi
Fraksi-fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom kemudian digabungkan dengan harga Rf yang sama. Penggabungan fraksi-fraksi dilakukan dengan analisiskromatografi lapis tipis
terhadap fraksi etilasetat. Fraksi 55-68 dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
Merck dan fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana : etil asetat dengan perbandingan pelarut 60:40 vv. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari harga Rf yang sama
pada setiap fraksi hasil kromatografi kolom. Untuk melihat perubahan eludasi, kromatogram lapis tipis diberi tanda batas atas dan batas bawah dengan menggunakan pensil. Fraksi
ditotolkan pada garis awal lempeng lapis tipis, kemudian dimasukkan kedalam chamber yang berisi eluen dan dibiarkan hingga eluen bergerak naik sampai batas atas.
Kromatogram lapis tipis disinari dengan lampu ultra violet untuk melihat spot-spot senyawa, selanjutnya lapis tipis difiksasi dengan larutan FeCl
3
5 menghasilkan spot hitam pada kromatogram lapisan tipis menujukkan positif mengandung senyawa fenol. Diamati
warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Rf yang sama kemudian
digabungkan menjadi satu fraksi kemudian diKTL kembali Lampiran D
Universitas Sumatera Utara
3.3.9 Pemurnian
Pasta yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan etilasetat. Kemudian ditambahkan n-heksan secara perlahan – lahan hingga terbentuk dua
lapisan. Kemudian didekantasi larutan bagian atas . Lalu diuapkan sisa pelarut hingga diperoleh pasta yang benar – benar bebas dari pelarut, hingga diperoleh senyawa murni
Jacobs, 1974.
3.3.10 Uji Kemurnian Hasil Isolasi
1.Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengankromatografi lapis tipis. Senyawa hasil isolasi yang diperoleh dilarutkan dengan pelarut etilasetat, elusidasi dilakukan dengan
menggunakan eluen yang dibuat dengan beberapa perbandingan pelarut yakni pelarut n- heksan : etilasetat perbandingan 60:40 vv, pelarut kloroform : metanol perbandingan 80:20
vv, pelarut etilasetat : metanol perbandingan 90:10 vv. Untuk melihat perubahan elusidasi, kromatogram lapis tipis diberi tanda batas atas dan batas bawah dengan menggunakan pensil.
Senyawa hasil isolasi ditotolkan pada batas bawah lempeng lapis tipis, kemudian dimasukkan kedalam chamber yang berisi eluen dan dibiarkan hingga bergerak sampai batas atas.
Kromatogram lapis tipis disinari dengan lampu ultra violet untuk melihat spot-spot senyawa, kemudian ditandai dengan pensil dan dihitung nilai Rf-nya. Selanjutnya lapis tipis
difiksasi dengan larutan FeCl
3
5 menghasilkan spot hitam yang tunggal pada kromatogram lapisan tipis menujukkan positif mengandung senyawa flavonoida. Diamati warna noda yang
timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Dilakukan hal yang sama pada setiap perbandingan eluen yang digunakan untuk mengetahui hasil pemisahan kromatogram lapisan
tipis. Hasil pemisahan kromatogram lapis tipis hasil isolasi murni diperoleh satu noda
Lampiran E.
Universitas Sumatera Utara
3.3.11 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
