a. kromatografi gas–cair b. kromatografi kolom kapiler
Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa senyawa – senyawa yang dipisahkan terdistribusi diantara fasa gerak dan fasa diam dalam perbandingan
yang sangat berbeda – beda dari satu senyawa terhadap senyawa yang lain Sastrohamidjojo, 1985.
2.4.2.1 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi Lapis Tipis pada plat berlapis yang berukuran lebih besar, biasanya 5x20 cm, 10x20 cm, atau 20x20 cm. Biasanya memerlukan waktu pengembangan 30 menit sampai satu
jam. Pada hakikatnya KLT melibatkan dua fase yaitu fase diam atau sifat lapisan, dan fase gerak atau campuran pelarut pengembang. Fase diam dapat berupa serbuk halus yang
berfungsi sebagai permukaan penyerap atau penyangga untuk lapisan zat cair. Fase gerak dapat berupa hampir segala macam pelarut atau campuran pelarut Sudjadi, 1986.
Pemisahan senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis seperti senyawa organik alam dan senyawa organik sintetik dapat dilakukan dalam beberapa menit dengan alat yang
harganya tidak terlalu mahal. Jumlah cuplikan beberapa mikrogram atau sebanyak 5 g dapat ditangani. Kelebihan KLT yang lain ialah pemakaian jumlah pelarut dan jumlah cuplikan
yang sedikit. Kromatografi Lapis Tipis KLT merupakan salah satu metode pemisahan yang cukup sederhana yaitu dengan menggunakan plat kaca yang dilapisi silika gel dengan
menggunakan pelarut tertentu Gritter, 1991.
Universitas Sumatera Utara
Lempeng lapis penyerap sering menggunanakan indikator flueresensi sehingga bahan alam yang mengabsobsi sinar uv gelombang pendek 245 nm akan tampak sebagai bercak
hitam pada latar hijau
2.4.2.2 Kromatografi Kolom
Pemisahan senyawa dengan kromatografi kolom merupakan salah satu teknik pemisahan biokimia yang banyak dipakai. Hal yang perlu diperhatikan adalah penyediaan kolom,
operasi kolom, serta pemilihan pelarut yang tepat sebelum melakukan kromatografi. Kolom kromatografi biasanya terbuat dari gelas. Panjang kolom biasanya disesuaikan dengan jumlah
komponen yang akan dianalisa dalam suatu senyawa, sedangkan lebar kolom disesuikan dengan jumlah senyawa yang akan dianalisis.
Bahan yang dapat dipakai untuk sediaan kromatografi sebagai pengisi kolom cukup banyak jenisnya. Sebagai contoh adalah beberapa jenis gel yang dapat menyerap air hidrofi;
suatu matriks isi kolom yang dapat aktif dengan pemanasan atau perlakuan dengan asam; dan untuk pertukaran ion resin, yang diperlakukan adalah bentuk ionik yang dapat dicuci.
Selama proses kesetimbangan dengan pelarut, bahan pengisi kolom dibiarkan mengendap, dan partiket-partikel halus yang tertinggal dalam suspensi dibuang dengan cara dekantasi.
Kolom kromatografi harus benar-benar padat, bahan kolom kira-kira sepertiga pelarutnya dan penambahan bahan kolom pada pelarut harus hati- hati. Awalnya sampel
dilarutkan dengan pelarut atau dapat ditambahkan dengan larutan buffer bila diperlukan, atau dielusi dengan larutan buffer setelah masuk kedalam kolom. Lebih baik kalo turunnya pelarut
pada kolom dibantu dengan membuka kran agar larutan menetes hingga isi kolom lebih cepat turun. Saat meneteskan sampel dengan pipet pada permukaan kolom, sebaiknya kran kolom
dibuka, agar eluen menetes dan sampel masuk kedalam kolom Bintang, 2011.
Universitas Sumatera Utara
Penjerap dapat dikemas kedalam tabung, dengan cara basah maupun dengan cara kering. Pada cara kering, adsorbent diletakkan didalam kolom, penjerap dituangkan kedalam
tabung sedikit demi sedikit. Setelah siap penambahan permukaan diratakan dan dimampatkan sedikit menggunakan alat pemampat. Alat pemampat ini dapat berupa sumbat karet atau
silinder kayu yang dipasang pada ujung batang kaca atau gagang. Setelah semua penjerap dimasukkan, diatasnya diletakkan kertas saring. Kemudian pengelusi dibiarkan mengalir
kebawah melalui penjerap dengan kran terbuka sampai permukaan pelarut tepat sedikit diatas bagian kolom. Cara basah , adsorben dimasukkan kedalam kolom, dan tabung diisi dengan
sepertiganya dengan pelarut. Pelarut yang dipakai untuk proses pengemasan sesuai dengan pelarut yang akan digunakan dalam kromatografi kolom atau mungkin pelarut yang
kepolarannya lebih rendah.
Kromatografi cair yang dilakukan dalam kolom besar merupakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan dalam jumlah besar lebih dari 1 g. Pada kromatografi kolom,
campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, dan tabung plastik. Pelarut atau fasa gerak
dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang
berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari atas kolom Gritter, 1991.
Dengan menggunakan cara ini, skala isolasi senyawa fenol dapat ditingkatkan hampir ke skala industri. Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran fenol berupa
larutan diatas kolom yang berisi serbuk penyerap seperti selulose, silika atau poliamida, dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang cocok. Kolom
hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujungMarkham, 1988.
Universitas Sumatera Utara
2.4.2.3 Harga Rf Reterdation Factor
