13
BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara ekperimental berdasarkan rancangan acak lengkap. Penelitian ini meliputi pengumpulan tumbuhan,
identifikasi tumbuhan, pengolahan tumbuhan, karakterisasi simplisia, pembuatan ekstrak, penyiapan hewan percobaan dan pengujian efek antidiare secara oral pada
hewan percobaan. Data hasil penelitian akan dianalisis secara ANOVA analisis variansi dan dilanjutkan dengan uji beda rata-rata Duncan menggunakan program
SPSS Statistical Product and service solution versi 16.
3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat-alat
Alat alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas laboratorium, alat perkolator, blender Panasonik, freeze dryer Edward, rotary
evaporator Buchi, oven listrik Fischer scientific, mikroskop Olimpus, kandang tikus, lemari pengering, neraca kasar Ohaus, neraca listrik Chyo JP2-
600, kandang tikus, neraca hewan Presica Geniweigher GW-1500, oral sonde,
seperangkat alat destilasi, stopwatch, spuit 1 ml , spuit 3 ml Terumo. 3.1.2 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bahan tumbuhan dan bahan kimia. Bahan tumbuhan yang digunakan adalah majakani.
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis, amil alkohol, asam asetat anhidrida, asam klorida pekat,
asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzene, besi III klorida, bismuth III nitrat, etanol, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, klorofrom, natrium
Universitas Sumatera Utara
14 hidroksida, karboksi metil selulosa CMC, loperamid HCl tablet Imodium
®
; Jansen-Cilag, oleum ricini.
3.2 Pengumpulan dan Pengolahan sampel 3.2.1 Pengumpulan sampel
Pengambilan sampel majakani dilakukan secara purposif yang dibeli dari toko obat tradisional di Pasar Sambu, Medan. Gambar simplisia dapat dilihat
pada Lampiran 3, halaman 43.
3.2.2 Identifikasi sampel
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI, Bogor.
Identifikasi bertujuan untuk memastikan kebenaran tumbuhan yang akan digunakan dalam penelitian. Hasil Identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 1,
halaman 41.
3.2.3 Pengolahan sampel
Majakani yang diperoleh sudah berupa sampel kering, kemudian dibersihkan dari kotoran dengan menggunakan kain basah, kemudian dikeringkan
di dalam lemari pengering dan ditimbang. Sampel kering diserbukkan dihaluskan dan ditimbang berat serbuk keringnya. Bagan kerja penelitian dapat
dilihat pada Lampiran 6, halaman 46-47.
3.3 Pembuatan Pereaksi 3.3.1 Besi III klorida 1 bv
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling sampai 100 ml Depkes, 1995.
Universitas Sumatera Utara
15
3.3.2 Larutan asam klorida HCl 2N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling sampai
100 ml Ditjen POM, 1979. 3.3.3 Timbal II asetat 0,4 M
Timbal II asetat sebanyak 15,17 g dilarutkan dalam air suling bebas CO
2
hingga 100 ml Depkes, 1995.
3.3.4 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,36 g raksa II klorida, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu
dilarutkan dalam 20 ml air suling. Kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan
air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes, 1995. 3.3.5 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 ml
Depkes, 1995. 3.3.6 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,8 g bismut III nitrat dilarutkan dalam asam nitrat pekat 20 ml kemudian dicampurkan dengan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 g dalam 50
ml air suling. Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih diambil dan diencerkan dengan air suling secukupnya hingga 100 ml Depkes,
1995. 3.3.7 Larutan kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Ditjen POM, 1979.
Universitas Sumatera Utara
16
3.3.8 Larutan pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,5 ml asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling hingga
diperoleh 100 ml Depkes, 1995. 3.3.9 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling secukupnya kemudian ditambahkan 2 g iodida sedikit demi sedikit, cukupkan dengan air
suling sampai 100 ml Depkes, 1995. 3.3.10 Pereaksi Liebermann-Burchard
Campur secara perlahan 5 ml asam asetat anhidrida dengan 5 ml asam sulfat pekat tambahkan etanol hingga 50 ml Merck, 1978.
3.4 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia
Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan
kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar abu total, dan pemeriksaan kadar abu yang tidak larut dalam asam Depkes, 1995; WHO, 1992.
3.4.1 Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap simplisia majakani meliputi bentuk, bau, warna dan rasa. Gambar simplisia dapat dilihat pada Lampiran 3,
halaman 43.
3.4.2 Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik terhadap simplisia dilakukan dengan cara menaburkan serbuk simplisia di atas kaca objek yang telah diteteskan dengan
larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup kemudian dilihat dibawah
Universitas Sumatera Utara
17 mikroskop. Dilakukan juga pemeriksaan mikroskopik dengan menggunakan
akuades.
3.4.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode azeotropi destilasi toluene. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin,
tabung penyambung dan tabung penerima 10 ml. Cara penetapan:
Toluena sebanyak 200 ml dan air suling sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam labu alas bulat, kemudian di destilasi selama 2 jam. Setelah itu toluena
didinginkan selama 30 menit dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml volume I. Kemudian ke dalam labu alas bulat tersebut
dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mulai mendidih, destilasi dengan
kecapatan 2 tetes tiap detik, hingga sebagian besar air terdestilasi. Kemudian kecepatan destilasi ditingkatkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah 2 jam didestilasi
semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena yang telah dijenuhkan. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima
dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml Volume II. Selisih kedua
volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992. Hasil Perhitungan
kadar air dapat dilihat pada Lampiran 7, halaman 48.
3.4.4 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus platina atau krus silikat yang telah dipijar dan ditara,
Universitas Sumatera Utara
18 kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran
dilakukan pada suhu 600
o
C selama 3 jam. Kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah
dikeringkan di udara Depkes, 1995. Hasil penetapan kadar abu total dapat dilihat pada Lampiran 10, halaman 51.
3.4.5 Penetapan kadar abu tidak larut asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan abu didinginkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring dengan kertas masir atau kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan
ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bobot yang dikerignkan di udara Depkes, 1995. Hasil penetapan kadar abu tidak larut asam
dapat dilihat pada Lampiran 11, halaman 52.
3.4.6 Penetapan kadar sari larut etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring, 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah
ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes,
1995. Hasil penetapan kadar sari larut etanol dapat dilihat pada Lampiran 9, halaman 50.
3.4.7 Penetapan kadar sari larut air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml
Universitas Sumatera Utara
19 dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan
selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa
dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes,
1995. Hasil penetapan kadar sari larut air dapat dilihat pada Lampiran 8, halaman 49.
3.5 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia simplisia meliputi golongan senyawa alkaloida, glikosida, glikosida antrakinon, saponin, tanin, dan steroidatriterpenoida. Dimana
dilakukan skrining fitokimia dilakukan terhadap simplisia majakani dan ekstrak etanol majakani.
3.5.1 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia dan ekstrak etanol majakani ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan
diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji alkaloida: diambil 3 tabung reaksi, lalu kedalamnya
dimasukkan 0,5 ml filtrat.
Pada masing-masing tabung reaksi;
1. ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer 2. ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat
3. ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhkan pada paling sedikit
dua dari tiga percobaan diatas Depkes, 1995.
Universitas Sumatera Utara
20
3.5.2 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia dan ekstrak etanol majakani ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam
keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah.
Flavonoida positif jika terjadi warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.5.3 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia dan ekstrak etanol majakani ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam
klorida 2 N, direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok,
didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan
dan diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50
٥
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan
percobaan dimasukan dalam tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara perlahan-
lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan ikatan gula Depkes,
1995.
3.5.4 Pemeriksaan antrakinon
Serbuk simplisia dan ekstrak etanol majakani ditimbang sebanyak 0,2 g, kemudian ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin
ditambahkan 10 ml benzena, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzena
Universitas Sumatera Utara
21 dipisahkan dan disaring, kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N,
didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon Depkes, 1995.
3.5.5 Pemeriksaan saponin
Serbuk simplisia dan ekstrak etanol majakani ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas,
dinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan
penambahan 1 tetes asam klorida 2N menunjukan adanya saponin Depkes, 1995. 3.5.6 Pemeriksaan tanin
Serbuk simplisia dan ekstrak etanol majakani ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 3 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring.
Pada filtrat ditambahkan 1-2 tetes peraksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukan adanya tanin Farnsworth,
1966. 3.5.7 Pemeriksaan steroidatriterpenoida
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dan ekstrak etanol majakani dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan
penguap. Pada sisa ditambahkan beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru atau biru
hijau menunjukan adanya steroida triterpenoida Depkes, 1995.
3.6 Pembuatan Ekstrak Etanol Majakani EEM
Pembuatan ekstrak etanol majakani dilakukan secara maserasi menggunakan etanol 80 Depkes, 1979.
Universitas Sumatera Utara
22 Cara kerja:
Sebanyak 1800 g serbuk simplisia majakani dimasukkan ke dalam wadah kaca berwarna gelap, kemudian dituangi dengan 7500 ml etanol 80. Ditutup dan
dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, disaring hingga didapat maserat. Ampas dicuci dengan 1500 ml etanol 80, dipindahkan
ke dalam bejana tertutup, dibiarkan ditempat sejuk, terlindung dari cahaya selama 2 hari, selanjutnya disaring. Maserat etanol yang diperoleh diuapkan dengan
menggunakan rotary evaporator pada temperatur ± 40 C sampai diperoleh
ekstrak kental kemudian dikeringkan menggunakan freeze dryer.
3.7 Percobaan Efek Antidiare
Kategori