Tabel 5 Anjuran penggunaan MSMn
No. Takaran Penggunaan
Keterangan
1. 1 sendok makan 6 ml
Dianjurkan untuk keluarga yang terdiri dari 2 orang dewasa dan 1 orang anak
2. 1 sendok teh 4 ml
Dianjurkan untuk keluarga yang terdiri dari 1 orang dewasa dan 1 orang anak
3. 1 kecrotan ±3 ml
Dianjurkan untuk 1 orang dewasa
3.3.2.3. Pengambilan Darah
Pengambilan darah responden 16 orang dilakukan sebelum dan sesudah konsumsi produk minyak sawit mentah selama 2 bulan, dengan
menggunakan jasa perawat yang terlatih untuk pengambilan darah di Puskesmas setempat. Volume darah yang diambil yaitu sekitar 20 ml
dengan menggunakan vacutainer berisi antikoagulan EDTA 0,1 dan standar peralatan pengambilan darah yang diperlukan.
Gambar 8 Pengambilan darah secara aseptis: A Proses pengambilan darah B Sampel darah dalam vacutainer
3.3.3. Isolasi Limfosit Damayanthi et al. 2004
Metode yang digunakan berdasarkan Current Protocols in Immunology. Darah yang ada dalam vacuntainer berisi EDTA dipindahkan ke dalam tabung
sentrifus, kemudian disentrifus pada 1500 rpm selama 10 menit. Bagian darah yang lebih berat sel darah merah akan berada pada bagian paling bawah. Di
antara lapisan sel darah merah dan plasma darah terdapat lapisan buffycoat, di mana lapisan tersebut berisi sel-sel limfosit.
A B
ditamb Campu
dinding kemudi
muda disisak
berbent putih k
limfosi menem
sedangk tabung
menghi Pencuc
volume Setelah
limfosi limfosi
limfosi Buffycoat
ahkan larut uran tersebu
g tabung ian disentrif
yang terlet an ± 1 m
tuk cincin p keruh dan di
it dan mono mbus histop
kan granul sentrifus.
Selanjutnya ilangkan m
cian ini dil e larutan ci
h itu, buang it yang terd
it dilakukan it yang ting
dimasukkan tan RPMI-1
ut dilewatkan sehingga t
fus pada 25 tak di bag
ml, kemudia putih diam
ipindahkan osit tidak m
paque sehin osit dan se
Gamb a dilakuka
monosit, pl lakukan de
incin putih g larutan b
dapat pada b n sebanyak
ggi. RPMI s n dalam ta
1640 SIGM n secara per
terbentuk d 500 rpm sela
gian atas d an larutan
mbil sampai ke tabung s
empunyai d ngga berad
el darah m
ar 9 Pemisa an pencuci
lasma dan engan cara
dan sentri erwarna m
bagian baw 2 kali sehin
sebanyak 5 abung sentr
MA R6504 rlahan-lahan
dua lapisan ama 30 men
dalam tabu sisanya y
batas enda sentrifus yan
densitas yan da di bagi
merah akan
Campuran
Sel limfos
Granulosi ahan sel lim
ian limfos histopaqu
a menamba ifus pada 1
erah muda wah tabung
ngga dipero ml ditamba
rifus yang dengan pe
n di atas his n yang tid
nit. Larutan ung sentrifu
yang meng apan larutan
ng baru Ga ng cukup tin
ian atas ta berada pad
n plasma da
sit
it dan sel da mfosit
sit yang b e yang m
ahkan RPM 1500 rpm s
RPMI da sentrifus. P
oleh kemurn ahkan kemb
baru kemu erbandingan
stopaque m dak bercam
berwarna m us dibuang
gandung la n yang berw
ambar 9. S nggi untuk
abung sent da bagian
an RPMI
arah merah
bertujuan u mengkontam
MI sebanya selama 5 m
an sisakan Proses penc
nian suspen bali pada ta
udian n 1:1.
elalui mpur,
merah g dan
apisan warna
el-sel dapat
trifus, dasar
untuk minasi.
ak 2x menit.
pelet cucian
nsi sel abung
sentrifus yang mengandung pelet limfosit, kemudian divorteks dan disimpan dalam freezer bersuhu ± - 20°C sampai siap dilakukan analisis selanjutnya.
3.3.4. Analisis Kadar Protein Limfosit dengan Metode Bradford 1976
3.3.4.1. Pembuatan Reagen Bradford untuk 500 ml
Coomasie Brilian Blue G-250 ditimbang sebanyak 0,05 gram,
kemudian ditambahkan 25 ml etanol 95 dan 50 ml asam fosfor 85. Campuran tersebut ditambahkan dengan aquades sampai volume 500 ml
dan dikocok kuat dalam erlenmeyer.
3.3.4.2. Pembuatan Protein Standar
BSA Bovine Serum Albumine ditimbang sebanyak 0,01 gram, kemudian ditambahkan 10 ml aquades sehingga diperoleh BSA dengan
konsentrasi 1000 ppm.
3.3.4.3. Pengenceran Seri Larutan BSA dan Pembuatan Kurva Standar
Pengukuran standar protein terlarut dilakukan pada konsentrasi 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700. 800, 900, dan 1000 ppm. Kemudian seri
larutan standar tersebut ditambahkan dengan 5 ml reagen Bradford, divortex dan diinkubasi pada suhu ruang selama ± 60 menit. Larutan ini
akan berwarna biru dan dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Dengan menggunakan regresi linear akan didapatkan
persamaan matematik untuk larutan standar protein yang telah diperoleh dari nilai absorbansi standar yang akan digunakan pada pengukuran kadar
protein limfosit.
3.3.4.4. Pengukuran Protein Limfosit
Suspensi limfosit dari 16 responden diambil sebanyak 0,1 ml, kemudian ditambahkan dengan 5 ml reagen Bradford, divorteks dan
inkubasi pada suhu ruang selama ± 60 menit. Selanjutnya dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Nilai absorbansi yang
diperoleh, dimasukkan ke dalam persamaan matematik yang didapatkan
dari kurva standar protein sehingga didapatkan nilai kadar protein limfositnya.
3.3.5. Analisis Kadar Protein CD4 dan CD8 dengan Metode ELISA
Zakaria et al. 2006
Suspensi limfosit dengan kadar protein 50 µg dimasukkan ke dalam mikroplate 96 wheel, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam.
Cairan dalam mikroplate dibuang dengan cara membalik mikroplate dan dihentakkan dan dicuci dengan PBST larutan PBS dengan 0,05 Tween 20.
Selanjutnya ditambahkan casein 3 pada masing-masing wheel dan inkubasi pada 37°C selama 2 jam. Cairan dalam mikroplate dibuang dan dicuci dengan
PBST. Kemudian ditambahkan antibodi primer, yaitu antibodi monoclonal anti-CD4 human produced in mouse
perbandingan 1 : 3000 atau antibodi monoclonal anti-CD8 human produced in mouse
perbandingan 1 : 1000 sebanyak 100 µl dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam. Cairan dalam
mikroplate dibuang dan dicuci dengan PBST. Antibodi sekunder antibodi HRP IgG anti-mouse ditambahkan sebanyak 100 µl dan inkubasi pada suhu
37°C selama 1 jam. Cairan dalam mikroplate dibuang dan dicuci dengan PBST. Substrat ABTS ditambahkan sebanyak 50 µl dan inkubasi pada suhu
ruang selama 15 menit. Jika penambahan substrat ABTS ke dalam wheel dapat dilakukan antara 2-3 menit, maka tidak diperlukan penambahan stop solution
SantaCruz 2011. Penghitungan waktu inkubasi dimulai sejak penambahan substrat pada wheel terakhir. Substrat ABTS yang mengandung peroksida
H
2
O
2
akan berinteraksi dengan enzim HRP pada antibodi sekunder sehingga akan terbentuk produk yang berwarna biru kehijauan. Intensitas warna
terbentuk dapat dibaca dengan Elisa Reader pada panjang gelombang 450 nm.
3.3.6. Analisis Data
Data hasil pengujian ELISA akan dianalisis menggunakan perhitungan statistik uji t berpasangan, yaitu dengan membandingkan kadar protein CD4
dan CD8 antara sebelum dan sesudah konsumsi produk minyak sawit mentah. Data hasil wawancara dan pengisian kuesioner akan dianalisis untuk
mengetahui karakteristik responden dan tingkat penerimaan produk oleh
responden, yang meliputi respon awal produk, respon setelah penggunaan produk selama beberapa waktu berkaitan dengan rasa, aroma dan warna,
respon terhadap kemasan produk dan kelanjutan konsumsi produk.
