g. Pewarnaan dengan Haematoxylin dan Eosin − Jaringan pada kaca objek dilakukan deparafinisasi dengan xylol
selama 2x2 menit. − Hidrasi dengan alkohol 100 selama 2x2 menit; alkohol 95
selama 2 menit; 90 selama 2 menit, 80 selama 2 menit; 70 selama 2 menit; air kran selama 3 menit.
− Inkubasi dalam larutan Haematoxylin Mayer selama beberapa menit.
− Cuci dalam air kran mengalir selama 15-20 menit. − Observasi di bawah mikroskop, bila masih terlalu biru cuci lagi
dengan air mengalirbbeberapa menit. Bila sudah cukup warna lanjutkan dengan counterstaining.
− Counterstaining dengan Eosin working solution beberapa menit. − Dehidrasi dengan larutan alkohol dengan gradasi peningkatan
persentase dari 70, 80, 90, 95, 100 masing-masing selama 2 menit.
− Inkibasi dengan Xylol 2x masing-masing selama 2 menit. − Mounting dengan Entellan
TM
− Beri label dan biarkan hingga entellan mongering. Hasil pewarnaan pada inti berwarna biru dan sitoplasma berwarna kemerahan.
balsam Kanada dan cover glass.
3.10.4 Pembacaaninterpretasi sediaan
slide histologi pengukuran ketebalan jaringan
Ketebalan lapisan kolagen pada jaringan selaput ketuban diukur dengan menggunakan mikroskop Primostar ZEISS yang dilengkapi kamera Axiocam
Universitas Sumatera Utara
ERc5s. Tiap sediaan diperiksa pada 3 area dengan arah jam 12; teknik Fujikura Benirschke and Kaufmann, 2006 yang masing-masing mewakili tiap lapisan
dari gulungan selaput ketuban. Prosedur pembacaan dilakukan sebagai berikut: Setelah sediaan
diletakkan di mikroskop, dipilih lapang pandang dengan pembesaran 10 kali. Pada monitor komputer yang dilengkapi software Axiovision Rel. 4.8.2 06-2010
tampak beberapa MENU pilihan. Pada toolbar tampak MENU Live, lalu ditentukan area yang akan diukur, pilih MENU Snap kemudian Measure. Dari
menu ini dipilih option Length dan dengan menggunakan mouse tarik garis dari batas bawah epitel aminon sampai batas bawah membran basal korion pada
daerah yang berwarna merah sesuai dengan gambaran kolagen dari pewarnaan tersebut. Hasil tersebut adalah ketebalan kolagen pada lapisan amnion dan korion.
Data gambar dan hasil pembacaan kemudian disimpan dalam file.
3.10.5 Prosedur pembuatan sediaan slide imunohistokimia
1. Dilakukan deparafinisasi sediaan dengan memasukkan sediaan ke dalam larutan xylol 1, xylol 2 dan xylol 3 selama masing-masing
5 menit 2. Kemudian dilakukan proses rehidrasi untuk menghilangkan sisa xylol
dengan menggunakan larutan alkohol absolut, alkohol 90, alkohol 80, alkohol 70 selama masing-masing 4 menit
3. Lalu sediaan dicuci di bawah air mengalir selama 5 menit 4. Masukkan sediaan ke dalam mesin pengering merk PT Link Dako
Epitop Retrieval lalu diatur set up preheat 65 ⁰C, running time 98⁰ C
selama 15 menit . Tunggu sampai ±1jam sampai sediaan kering.
Universitas Sumatera Utara
5. Selanjutnya jaringan pada sediaan dilingkari dengan spidol Pap pen agar pada saat penetesan antibody atau cairan lainnya tidak keluar
melewati batas lingkaran Pap pen. Kemudian segera dimasukkan ke dalam larutan Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 selama 5 menit
6. Kemudian dilakukan blocking dengan peroksidase selama 5-10 menit dan dicuci TBS pH 7,4 selama 5 menit
7. Selanjutnya dilakukan blocking dengan Normal Horse Serum NHS 3 selama 15 menit dan dicuci dengan TBS pH 7,4 selama 5 menit
8. Jaringan pada sediaan ditetesi antibodi primer antibodi anti-Human fibronectin purified clone FN-3
eBioscience
9. Lalu dicuci kembali dengan TBS pH 7,4 dan Tween 20 selama 5 menit
dengan pengenceran 1 : 100 dan di-inkubasi selama 1 jam
10. Selanjutnya jaringan pada sediaan ditetesi Dako Real Envision RabbitMouse dan inkubasi selama 30 menit dan kembali dicuci
dengan TBS pH 7,4 dan Tween 20 selama 5 -10 menit 11. Jaringan pada sediaan ditetesi Diamino Benzidine DAB+substrat
chromogen solution dengan pengenceran 20 µl DAB: 1000 µl substrat dan diinkubasi selama 5 menit lalu dicuci kembali dengan air mengalir
12. Selanjutnya dilakukan pewarnaan dengan Hematoxylin selama 10 menit
13. Cuci dibawah air mengalir selama 5 menit dan celupkan sediaan ke dalam lithium karbonat 5 dalam aqua selama 2 menit dan cuci
kembali di bawah air mengalir selama 5 menit
Universitas Sumatera Utara
14. Selanjutnya dilakukan proses pengeringan melalui proses dehidrasi dengan menggunakan alkohol 80, alkohol 90 dan alkohol absolut
selama masing-masing 5 menit 15. Kemudian dilakukan clearing dengan menggunakan larutan xylol 1,
xylol 2 dan xylol 3, masing-masing 5 menit 16.
Selanjutnya dilakukan mounting dan tutup sediaan dengan coverglass dan sediaan siap untuk dinilai. Singapore General HospitalSGH
methode
3.10.6 Pembacaaninterpretasi sediaan slide imunohistokimia tampilan
