BAB 3
BAHAN DAN METODA
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober sampai dengan Desember 2010 di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan. Pengamatan mikroskopik dilakukan di Laboratorium Ilmu Dasar Universitas Sumatera Utara. Sedangkan bahan
tanaman berupa jeruk keprok berasal dari pasar Situmba, desa Gunung Tua Baringin, Kecamatan Sipirok, Kabupaten Tapanuli Selatan, Sumatera Utara.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
Adapun alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, entkas, lampu ultraviolet, botol kultur, aluminium foil, pipet serologi, alat diseksi, gelas piala, gelas
ukur, neraca analitik, erlenmeyer, cawan petri, kertas saring, shaker, bunsen, pH meter, pipet serologi, pipet tetes, spatula, mikroskop, gelas objek dan penutup gelas.
Bahan penelitian yang digunakan adalah embrio jeruk keprok Citrus nobilis
Lour. yang sudah masak, komposisi media MS, larutan pemutih NaOCl 5,25,
fungisida benlate, tween, alkohol 70, akuades, Ekstrak Malt ME 500 mgl, kinetin, NAA 0,05 mgl, agar-agar, gula, hara makro, hara mikro, iron, vitamin dan Myo-
inositol. 3.3 Metoda Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode percobaan dengan Rancangan Acak Lengkap RAL non faktorial dengan perlakuan variasi konsentrasi kinetin dengan 5 taraf yaitu:
Universitas Sumatera Utara
K : 0 ppm
K
1
: 1 ppm K
2
: 2 ppm K
3
: 3 ppm K
4
: 4 ppm Dengan jumlah ulangan sebanyak enam pada setiap perlakuan, maka jumlah botol
percobaan seluruhnya 30 satuan percobaan. Penelitian dilakukan dengan pengamatan sebanyak empat kali dalam waktu empat minggu, maka total botol seluruhnya adalah
120 satuan percobaan.
3.4 Prosedur Kerja 3.4.1 Sterilisasi Alat
Proses sterilisasi ini bertujuan agar seluruh alat yang digunakan terbebas dari kontaminasi. Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini seperti alat diseksi, cawan
petri yang diisi kertas saring, botol kultur, erlenmeyer dan pipet volume dicuci dengan deterjen lalu dibilas dengan air mengalir, dikeringkan dan disterilisasi dalam autoklaf
pada suhu 121 C dengan tekanan 15 Psi selama 60 menit. Bersamaan dengan alat
dimasukkan juga botol berisi akuades dan aluminium foil.
3.4.2 Pembuatan Media
Media yang digunakan untuk pertumbuhan planlet adalah media dasar MS Murashige Skoog dengan penambahan NAA, Ekstrak Malt ME, dan kinetin pada
konsentrasi 0, 1, 2, 3, 4 ppm. Komposisi Media MS dapat dilihat pada Lampiran A. Tahap awal pembuatan media adalah pembuatan larutan stok yang terdiri dari stok
hara makro, hara mikro, iron, dan vitamin. Sementara unsur lain seperti sukrosa dan agar dapat ditimbang langsung sesuai kebutuhan tanpa harus dijadikan larutan stok.
Pembuatan media sebanyak 1000 ml. 14
Universitas Sumatera Utara
Larutan MS dibuat dengan memasukkan hara makro, myo-inositol, dan sukrosa ke dalam gelas ukur 1000 ml yang terlebih dahulu telah berisi akuades. Lalu
hara mikro, iron, vitamin, sukrosa, 500 mgl Ekstrak Malt ME dan 0,05 mgl NAA dimasukkan ke dalam gelas ukur yang ditambah akuades hingga 1000 ml, kemudian
larutan dibagi menjadi 5 bagian sesuai perlakuan. Selanjutnya kinetin dimasukkan untuk masing-masing perlakuan. Derajat keasaman pH larutan diukur setiap
perlakuan dengan menggunakan pH meter sebesar 5,8. Untuk mendapatkan pH yang optimal maka ditambahkan NaOH 0,1 N atau HCl 0,1 N.
Pada setiap perlakuan dimasukkan agar yang telah ditimbang sebanyak 3,5 g dan media dipanaskan sampai mendidih. Larutan dituang ke dalam botol kultur steril
yang kemudian ditutup dengan aluminium foil dan diikat dengan karet, selanjutnya disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
C dengan tekanan 15 Psi selama 30 menit. Botol kultur ditempatkan di rak-rak kultur untuk menghindari kontaminasi Reinert
Bajaj, 1989.
3.4.3 Sterilisasi Embrio
Eksplan berupa embrio dari biji jeruk dibersihkan di bawah air mengalir selama 30 menit, dibilas dengan akuades steril. Kulit biji terluar dilepaskan lalu direndam dalam
benlate 0,2 g100 ml dan ditambahkan 2 tetes tween 20 lalu dishaker selama 120 menit. Biji tanpa kulit terluar tersebut direndam dengan alkohol 70 selama 1 menit,
dibilas 3 kali dengan akuades steril, direndam dalam larutan pemutih 5 selama 5 menit dan dibilas 3 kali dengan akuades steril, selanjutnya dengan larutan pemutih
2,5 selama 5 menit, dibilas 3 kali dengan akuades steril. Biji tersebut diletakkan di dalam cawan petri kemudian dikeringkan dengan kertas saring steril. Berikut Gambar
3.4.3 biji yang di dalamnya terdapat embrio sebagai eksplan.
Gambar 3.4.3 Embrio Dari Biji Jeruk Keprok a Kulit Biji b Biji Utuh c Kotiledon d Embrio
a b
c d
Universitas Sumatera Utara
3.4.4 Penanaman Embrio
Penanaman eksplan dilakukan di dalam entkas yang telah disterilisasi dengan sinar Ultraviolet UV. Botol-botol berisi media yang sudah disterilkan, dibuka tutupnya
dengan menggunakan pinset yang sudah dicelupkan pada alkohol dan telah dibakar. Lampu bunsen disediakan untuk mencegah kontaminasi. Kemudian setelah tutup botol
dibuka, bagian sekitar tutup botol dilewatkan di atas api bunsen untuk memperkecil kontaminasi. Eksplan diambil dari dalam cawan petri dengan menggunakan pinset
steril, lalu embrio digores pada permukaan untuk memperbesar keluarnya tunas lalu dimasukkan ke dalam botol kultur dengan menggunakan pinset steril. Botol kultur
ditutup dengan aluminium foil dan disusun dirak kultur. Berikut Gambar 3.4.4 penanaman embrio pada media MS.
a b
c Gambar 3.4.4 Penanaman Embrio Pada Media MS a Media MS Sebelum
Ditanam Embrio b Proses Penanaman Embrio c Media Berisi Embrio
3.4.5 Pemeliharaan Kultur
Eksplan yang telah ditanam di dalam botol kultur diletakkan pada rak pemeliharaan dengan kondisi ruangan yang steril, suhu berkisar 25
o
C. Intensitas cahaya dengan penyinaran lampu neon 500 lux. Botol-botol yang berisi eksplan tersebut disusun
dengan rapi sehingga memudahkan dalam pengamatan. Diupayakan ruangan dalam keadaan steril atau dengan menyemprotkan alkohol 70 setiap hari.
3.4.6 Pengamatan Mikroskopik
Alur kerja pengamatan mikroskopik akar dapat dilihat pada Lampiran J. Preparat anatomi akar dibuat dari akar planlet segar yang diambil dari masing-masing
Universitas Sumatera Utara
perlakuan dan pengamatan setiap minggunya. Bagian akar diiris tipis secara melintang lalu diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 4x10.
3.5 Variabel Pengamatan
Pengamatan dilakukan empat kali dengan interval waktu satu minggu. Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah :
a. Tipe Pertumbuhan Kultur
b. Jumlah Tunas buah
c. Berat Planlet g
d. Jumlah Daun buah
e. Panjang Tunas cm
f. Panjang Akar cm
g. Jumlah Akar cm
h. Pengamatan mikroskopik akar dari planlet dengan objek preparat segar yang
diambil dari setiap pengamatan interval pengambilan planlet 1 minggu i
.
Persentase kultur yang hidup Jumlah eksplan yang tumbuh
Persentase kultur yang hidup = X 100
Jumlah eksplan seluruh perlakuan
j.
Persentase kontaminasi keseluruhan Persentase kultur terkontaminasi dihitung setiap hari sejak awal hingga akhir
Jumlah eksplan yang terkontaminasi Persentase terkontaminasi =
X 100 Jumlah eksplan seluruh perlakuan
3.6 Analisis Data