D. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi Macaranga tanarius L. Müll. Arg.
Determinasi dilakukan dengan mencocokkan ciri-ciri makroskopis tanaman Macaranga tanarius L. Müll. Arg. dengan buku acuan. Determinasi
dilakukan di bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan uji
Bahan uji yang digunakan adalah daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. yang masih segar, besar, berwarna hijau dan kondisinya baik tidak berbintik-
bintik. Daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. dipanen pada bulan April-Mei 2015 dan dilakukan waktu pagi hari di wilayah Paingan, Maguwoharjo, Sleman,
DIY. 3.
Pembuatan serbuk daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg.
Daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. dicuci bersih kemudian dipotong untuk mempercepat pengeringan. Pengeringan dilakukan di oven pada
suhu 29°C. Setelah daun kering kemudian dilakukan penyerbukan menggunakan blender
Miyako®. Serbuk kemudian diayak dengan ayakan nomor mesh 50.
4. Penetapan kadar air serbuk daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg.
Serbuk kering daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. yang sudah diayak, dimasukkan ke dalam alat moisture balance sebanyak ± 5 g kemudian
diratakan. Bobot serbuk tersebut ditetapkan sebagai bobot sebelum pemanasan bobot A, setelah itu dipanaskan pada suhu 105°C. Serbuk kering daun Macaranga
tanarius L. Müll. Arg. yang sudah dipanaskan ditimbang kembali dan dihitung
sebagai bobot setelah pemanasan bobot B. Selisih bobot A terhadap bobot B merupakan kadar air serbuk daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg..
[ bobot sampel sebelum pemanasan − bobot sampel setelah pemanasan
bobot sampel sebelum pemanasan ] x
5. Pembuatan ekstrak metanol-air serbuk daun Macaranga tanarius L.
Müll. Arg.
Sebanyak 40 g serbuk daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. direndam dalam 200 mL pelarut metanol-aquadest 1:1 menggunakan bantuan
shaker selama 24 jam. Tujuan dilarutkan dalam pelarut metanol agar senyawa kimia
yang terkandung dalam daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. dapat larut dalam pelarut. Maserasi dilakukan menggunakan bantuan shaker untuk menghemat waktu
perendaman. Setelah dilakukan perendaman, hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner, yang dilapisi kertas saring, sehingga diperoleh
filtrat. Serbuk sisa perendaman diremaserasi dengan 100 mL metanol-air selama 24 jam. Filtrat dipindahkan dalam labu alas bulat untuk diuapkan menggunakan
rotary vacuum evaporator dengan suhu 80
o
C hingga menjadi ekstrak kental. Ekstrak kental dituang dalam cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya,
agar mempermudah perhitungan rendemen ekstrak yang akan diperoleh. Cawan porselen yang berisi ekstrak kental dikeringkan di oven pada suhu 50
o
C untuk mendapatkan ekstrak metanol-air daun Macaranga tanarius L Müll. Arg. dengan
bobot penimbangan ekstrak tetap. Pengeringan ekstrak dilakukan sampai susut pengeringan sebesar 0 sehingga diharapkan penyari ekstrak sudah tidak ada.
Waktu yang diperlukan hingga diperoleh bobot pengeringan ekstrak tetap berkisar antara 1-3 hari.
6. Pembuatan fraksi heksan-etanol ekstrak metanol Macaranga tanarius L.
Müll. Arg.
Ekstrak kental metanol-air daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. dimaserasi menggunakan pelarut heksan:etanol 1:1 dengan perbandingan
ekstrak:pelarut sebesar 1:5. Ekstrak kental dimaserasi menggunakan bantuan shaker
selama 24 jam dengan kecepatan 140 rpm. Hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner dan dituang ke dalam cawan porselen. Fraksi yang
diperoleh dikeringkan di dalam oven dengan suhu 50
o
C hingga diperoleh fraksi
kental dengan bobot penimbangan tetap. 7.
Pembuatan larutan CMC-Na 1 sebagai pelarut FHEMM
Larutan CMC-Na 1 dibuat dengan cara menimbang sebanyak 5,0 gram CMC-Na, kemudian dikembangkan menggunakan aquadest 200,0 mL dan
didiamkan selama 24 jam. Larutan tersebut kemudian ditambah aquadest hingga 500,0 mL pada labu ukur 500,0 mL.
8. Pembuatan sediaan FHEEM
Sediaan suspensi FHEEM dibuat dengan menimbang 600 mg FHEMM kemudian dilarutkan dalam 25 mL larutan CMC-Na 1. Pada proses pelarutan
dapat dibantu menggunakan sonicator selama 5-10 menit.
9. Pembuatan larutan karbon tetraklorida CCl
4
dalam olive oil
Larutan karbon tetraklorida CCl
4
dibuat dengan melarutkan CCl
4
dengan olive oil, dengan perbandingan volume 1:1 dan konsentrasi akhir yang diperoleh 50.
10. Penetapan dosis hepatotoksik CCl
4
Penetapan dosis CCl
4
dilakukan untuk mengetahui dosis CCl
4
yang dapat menyebabkan kerusakan hati tetapi tidak menyebabkan kematian. Dosis
hepatotoksik yang digunakan dalam penelitian ini mengacu pada penelitian Janakat dan Al-Merie 2002 yang melaporkan bahwa dosis karbon tetraklorida sebesar 2
mLKg BB dalam olive oil 1:1 dapat menyebabkan kerusakan sel-sel hati yang ditandai dengan peningkatan kadar ALT dan AST sebanyak 3-4 kali normal tetapi
tidak menyebabkan kematian hewan uji apabila diberikan secara intraperitoneal i.p.
11. Penetapan waktu pencuplikan darah
Penetapan waktu pencuplikan darah ditentukan melalui orientasi kadar ALT dan AST pada jam ke-0, 24, dan 48 setelah pemberian CCl
4
dengan dosis 2mLkgBB secara i.p. Masing-masing kelompok orientasi dilakukan dengan 3 ekor
tikus. Pengukuran kadar ALT dan AST dalam sampel darah dilakukan di Laboratorium Pusat Rumah Sakit Bethesda, Yogyakarta.
Pengukuran kadar ALT dan AST pada sampel darah untuk penentuan pencuplikan darah menggunakan reagen ASLGPT Therma Scientific untuk ALT
dan ASTGOT Therma Scientific untuk AST dengan metode IFCC.
12. Penetapan dosis FHEMM
Penetapan dosis FHEMM dihitung dengan konsentrasi larutan 600mg25mL FHEMM dalam CMC-Na 1 dengan berat badan maksimal tikus
350 gram. Dibuat 3 peringkat dosis dari konsentrasi tersebut, dengan volume pemberian 0,5 mL untuk dosis rendah, 1 mL untuk dosis tengah, dan 2 mL untuk
dosis tinggi. Perhitungan dosis sebagai berikut : a. Dosis rendah volume = 0,5 mL
D x B = V x C D =
, �
00 �� 2 ��
�
D = 0,03428 mgg BB D = 34,28 mgkgBB
b. Dosis tengah volume = 1 mL D x B = V x C
D =
�
00 �� 2 ��
�
D = 0,06857 mgg BB D = 68,57 mgkgBB
c. Dosis tinggi volume = 2 mL D x B = V x C
D =
�
00 �� 2 ��
�
D = 0,13714 mgg BB D = 137,14 mgkgBB
Berdasarkan perhitungan dosis di atas, maka dosis pemberian FHEMM adalah 34,28 mgKgBB; dosis tengah 68,57 mgkgBB; dosis tinggi 137,14
mgkgBB.
13. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Tiga puluh ekor tikus betina galur Wistar dibagi acak menjadi 6 kelompok dengan masing-masing kelompok berjumlah 5 ekor tikus. Enam
kelompok tersebut adalah kontrol hepatotoksin CCl
4
, kontrol FEAM jangka panjang, dan 3 perlakuan dosis jangka panjang
.
a. Kelompok I adalah kelompok kontrol CMC-Na sebagai pelarut FHEMM. Kelompok ini diberikan CMC-Na 1 dengan dosis 2mL350gBB secara peroral
p.o satu kali sehari selama 6 hari berturut-turut kemudian diambil darah pada hari ke-7.
b. Kelompok II adalah kelompok kontrol CCl
4
. Kelompok ini diberikan larutan CCl
4
dalam olive oil 1:1 dengan dosis 2mLkgBB secara i.p kemudian pada jam ke-24 diambil darahnya.
c. Kelompok III adalah kelompok kontrol dosis FHEMM. Kelompok ini diberikan sedian FHEMM dosis tertinggi yaitu 137,14 mgKgBB satu kali sehari selama 6
hari berturut-turut secara p.o kemudian pada hari ke-7 diambil darahnya. d. Kelompok IV adalah kelompok perlakuan FHEMM dosis rendah. Kelompok ini
diberikan sediaan FHEMM dosis rendah yaitu 34,28 mgKgBB satu kali sehari selama 6 hari berturut-turut pada waktu yang sama secara p.o. kemudian pada hari
ke-7 diberikan CCl
4
dengan dosis 2mLkgBB secara i.p.
e. Kelompok V adalah kelompok perlakuan FHEMM dosis tengah. Kelompok ini diberikan sediaan FHEMM dosis tengah yaitu 68,57 mgKgBB satu kali sehari
selama 6 hari berturut-turut pada waktu yang sama secara p.o. kemudian pada hari ke-7 diberikan CCl
4
dengan dosis 2mLkgBB secara i.p. f. Kelompok VI adalah kelompok perlakuan FHEMM dosis tinggi. Kelompok ini
diberikan sediaan FHEMM dosis tengah yaitu 2mL350gBB satu kali sehari selama 6 hari berturut-turut pada waktu yang sama secara p.o. kemudian pada hari
ke-7 diberikan CCl
4
dengan dosis 2mLkgBB secara i.p. Semua kelompok perlakuan FHEMM kelompok IV-VI diambil
darahnya pada jam ke-24 setelah pemberian CCl
4
. Pengambilan darah dilakukan pada daerah sinus orbitalis mata, kemudian ditampung pada tabung untuk dilakukan
pengukuran kadar bilirubin.
14. Pengukuran kadar bilirubin
Pengukuran kadar bilirubin dalam sampel darah dilakukan di Laboratorium Pusat Rumah Sakit Bethesda, Yogyakarta. Pemeriksaan bilirubin
sampel darah menggunakan reagen Bill T Therma Scientific dengan metode colorimetric
. Kandungan reagen yang digunakan tertera pada tabel I. Tabel I. Komposisi dan konsentrasi reagen Bill T
ThermoFisher Scientific, 2009. Perhitungan penurunan bilirubin diperoleh dengan rumus:
[ − purata bilirubin perlakuan − purata bilirubin kontrol
purata bilirubin kontrol hepatotoksin − purata bilirubin kontrol negatif ] x
Wakchaure, Jain, Singhai, dan Somani, 2013 Komposisi aktif
Konsentrasi Surfactant
1 Hydrochloric acid
100 mmolL Sulphanilic acid
5 mmolL
E. Tata Cara Analisis Hasil
Kategori