44
2 Kandang perlakuan : toples besar yang diberi lubang pada
beberapa bagian tepi agar dapat memasukkan rokok dengan tutup toples terpasang, spuit ukuran 5 ml sebagai pompa rokok,
selang bening untuk membuat pompa lebih panjang, wadah spidol untuk penjepit rokok.
2. Bahan
Bahan yang digunakan untuk penelitian antara lain mencit, pakan mencit, air minum, kulit buah manggis sebagai bahan utama
pembuatan ekstrak kulit buah manggis, rokok kretek merk “D”, kapas, sekam, formalin, cloroform untuk membius mencit yang akan dibedah,
dan kertas label untuk memberi labeltanda pada botol flakon.
F. Prosedur Kerja
1. Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis.
a. Menyiapkan buah manggis sebanyak 10 kilogram
b. Memisahkan buah, tangkai dan lapisan kulit terluar dari buah
manggis. c.
Memotong kulit manggis tipis-tipis agar proses pengeringan semakin cepat.
d. Menggiling kulit manggis yang telah kering hingga berbentuk
serbuk. e.
Serbuk ditimbang sebanyak 1 kg. lalu ditempatkan dalam maserator, selanjutnya dimasukkan pelarut ethanol 96 hingga
semua terbasahi, maserasi dilakukan selama 48 jam.
45
f. Diambil ekstraknya, ampas dimaserasi kembali hingga 2 kali
agar ekstrak yang didapatkan maksimal. 1 kg bubuk kulit buah manggis membutuhkan 8 liter ethanol 96.
g. Hasil maserasi dipekatkan dengan rotary evaporator hingga
didapatkan ekstrak kulit buah manggis berbentuk pasta berwarna cokelat.
h. Menimbang ektrak kulit buah manggis sebanyak dosis yang
diperlukan, melarutkan kedalam aquadesh dengan suspensor Tween dan PGA sebanyak 1-2 dari berat ekstrak.
i. Diperoleh ektrak kulit buah manggis dalam bentuk cair
sehingga memudahkan dalam proses pemberian ke hewan coba.
2. Penentuan Dosis Ekstrak Kulit Buah Manggis dan Asap Rokok
Pemberian dosis ekstrak kulit buah manggis untuk mencit adalah 280 mgKgBB, 560mgKgBB dan 860 mgKgBB.
Pemberian dosis rokok yaitu sebanyak 2 batang rokok selama 15 menit untuk kelompok yang diberi perlakuan yaitu kelompok KII,
KIII, KIVdan KV. Rokok yang digunakan adalah rokok nonfilter rokok kretek merk “D” secara inhalasi.
3. Perlakuan pada Mencit
Pembagian kelompok perlakuan mencit adalah sebagai berikut :
46
a. KI
: kelompok kontrol negatif yang terdiri dari 5 ekor mencit dengan dipelihara tanpa diberi perlakuan tanpa paparan asap rokok
dan tanpa ekstrak kulit buah manggis. b.
K II : kelompok kontrol positif yang terdiri dari 5 ekor mencit
dengan dipelihara + paparan asap rokok dari 2 batang rokokhari selama 15 menit.
c. KIII
: kelompok perlakuan yang terdiri dari 5 mencit yang dipelihara + paparan asap rokok dari 2 batang rokokhari selama 15
menit + ekstrak kulit buah manggis dengan dosis 280 mgKgBB perhari.
d. K IV : kelompok perlakuan yang terdiri dari 5 mencit yang
dipelihara + paparan asap rokokhari selama 15 menit + ekstrak kulit buah manggis dengan dosis 560 mgKgBB.
e. KV
: kelompok perlakuan yang terdiri dari 5 mencit yang dipelihara + paparan asap rokokhari selama 15 menit + ekstrak
kulit buah manggis dengan dosis 840 mgKgBB. 4.
Pembuatan Preparat Histologik Pembuatan preparat histologik trakea dan paru-paru mencit
dilakukan di Fakultas Kedokteran UGM Yogyakarta. Proses pembuatan preparat histologik dilakukan melalui beberapa tahapan
antara lain Suntoro, 1983: 48-72:
47
a. Fiksasi
Sampel organ trakea dan paru-paru yang diambil difiksasi dengan larutan formalin 10.
b. Trimming
pemotongan Jaringan dipotong tipis ± 10x10x3 mm dengan menggunakan
pisau skalpel No. 22-24. c.
Dehydration dehidrasi
Tahap ini dilakukan dengan menggunakan automatic histotechnician tisuue processor
. Dehidrasi dimaksudkan untuk mengeluarkan air yang terkandung dalam jaringan dan diganti
dengan ethanol alkohol. Caranya, memasukkan jaringan ke dalam alkohol 80 2 jam, alkohol 95 I 2 jam, 95 II 1
jam dan alkohol absolut 3 kali masing-masing 1 jam. d.
Clearing Clearing
penjernihan: larutan dehidran dibuang dan diganti dengan xylol sebanyak 3 kali masing-masing 1 jam, agar xylol
mudah diusir oleh parafin. e.
Infiltration penyusupan
Dilakukan di dalam oven dengan suhu 55-60ºC, menggunakan parafin dengan titik cair 56-58 ºC. Potongan organ dimasukkan
dalam botol jam yang berisi : 1 parafin 1 selama 2 jam; 2 parafin 2 selama 2 jam; 3 parafin 3 selama 2 jam.
48
f. Embedding
penyelubungan Kertas kalender dibuat kotak-kotak dengan ukuran 2 x 2 x 2
cm3 atau base mold untuk menanam jaringan. Parafin yang sudah dicairkan dituang dalam kotak-kotak tadi, lalu potongan
jaringan ditanam dalam parafin tersebut dan jaringan diletakkan di dasar parafinkemudian didinginkan.
g. Section
pengirisan Blok-blok parafin dikeluarkan dari cetakannya,dibentuk dan
diiris dengan skalpel berbentuk trapesium. Potongan
inikemudian dipasang pada holder yang kemudian dipasang pada mikrotom, kemudian dilakukan pengirisan preparat
sampai terbentuk pita coupes. h.
Affixing penempelan
Coupes ditempelkan di atas gelas benda yang sebelumnya telah
diolesi dengan albumin meyer, lalu ditetesi aquades secukupnya.
i. Deparafinisasi
dan staining Gelas benda yang ditempeli coupes direndam dalam xylol I
selama 5 menit, xylol II 5 menit dan xylol III 5 menit. Proses pewarnaan dimulai dengan pencelupan dalam alkohol
absolut I 5 menit, absolut II 5 menit, akuades 1 menit, lalu dimasukkan dalam Hematoxyline-Eosin kemudian dicelupkan
dan dibersihkan dalam akuades 1 menit. Lalu dimasukkan
49
dalam alkohol asam 2-3 celupan. Bahan lalu dimasukkan dalam akuades I 1 menit, akuades II 15 menit, Eosin 2 menit,
alkohol 96 I 3 menit, alkohol 96 II 3 menit, alkohol absolut III 3 menit, alkohol absolut IV 3 menit, kemudian
dimasukkan xylol IV 5 menit dan xylol V selama 5 menit. j.
Mounting penutupan
Coupes diambil dari larutan xylol kemudian dibersihkan
dengan kertas penghisap, lalu ditetesi dengan permount dan ditutup dengan gelas penutup.Selanjutnya preparat dikeringkan
di atas termostat.
G. Teknik Pengumpulan Data
