untuk memberikan kekuatan perlekatan pada pendukungnya. Bahan pengikat yang sering digunakan adalah gipsum, dan silika gel yang
diberikan tambahan senyawa, ini dikenal dengan istilah ”silika gel G”.
Kadang-kadang untuk mempermudah identifikasi diatambah zat yang berfluoresensi sehingga dikenal dengan istilah silika gel GF. Bahan
penjerap lain yang digunakan adalah alumina, selulosa, sefadex, poliamida, kieselguhr, dan amilum Harborne, 1973.
Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu mendeaktifkan permukaan silika gel karena air akan menutup sisi
aktif silika gel. Hal seperti ini dapat diatasi dengan memanaskan plat pada suhu 105ºC Gandjar dan Rohman, 2007.
b. Fase gerak
Fase gerak adalah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak di dalam fase diam yaitu lapisan
berpori karena ada gaya kapiler. Yang digunakan adalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan sistem pelarut multikomponen, maka
harus berupa suatu campuran sederhana mungkin terdiri atas maksimum tiga komponen Stahl, 1985.
Pemilihan sistem pelarut untuk mencapai sistem pemisahan yang diperlukan mungkin melibatkan beberapa percobaan, tetapi pilihan pelarut
cukup terbatas dengan pertimbangan interferensi respon detektor atau kerusakan yang mungkin terjadi dari fase diam Dean, 1995.
G. Densitometri
Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang mendasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada
plat KLT. Densitometri lebih dititikberatkan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar kecil, yang mana diperlukan pemisahan terlebih dahulu dengan
KLT Rohman, 2009. KLT-densitometri merupakan salah satu dari metode analisa kuantitatif.
Penetapan kadar suatu senyawa dengan metode ini dilakukan dengan mengukur kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT. Pada umumnya
pengukuran kerapatan bercak tersebut dibandingkan dengan kerapatan bercak senyawa standar yang dielusi bersama-sama Hardjono, 1985.
Metode densitometri mempunyai cara kerja yang sederhana dan cepat. Pada metode densitometri diperlukan adsorbens dan fase gerak yang murni. Untuk
memperoleh hasil yang baik umumnya digunakan adsorbens siap pakai yang telah mengalami pra pencucian Gritter, Bobbit, dan Schartin, 1991.
Alat densitometer mempunyai sumber sinar yang bergerak di atas bercak pemisahan pada lempeng kromatografi yang akan ditetapkan kadar komponennya.
Lempeng digerakkan menyusuri berkas sinar yang berasal dari sumber sinar tersebut. Bercak yang kecil dan intensif akan menghasilkan suatu puncak kurva
absorbsi yang sempit dan tajam, sebaliknya bercak yang lebar akan menghasilkan puncak kurva absorbsi yang melebar dan tumpul Sudjadi, 1988.
Teknik pengukuran dapat didasarkan atas pengukuran intensitas sinar yang diserap absorbansi, intensitas sinar yang dipantulkan reflaktansi atau
intensitas sinar yang difluoresensikan fluoresensi Mintarsih, 1990. Pada beberapa alat TLC scanner sudah dilengkapi alat pemroses data
atau mikro komputer, sehingga integrasi luas puncak atau tinggi puncak tersebut dapat langsung direkam atau dicatat sebagai data sekaligus dengan
kromatogramnya dan dapat pula direkam dan dicatat langsung sebagai kadarnya, melalui teknik pemrogaman tertentu. Penelusuran bercak dapat dilakukan secara
horizontal maupun vertikal scanning horizontal atau scanning vertical. Penelusuran bercak secara horisontal dapat dilakukan satu persatu, atau apabila
satu pelat bercak yang diperoleh segaris semua maka dapat dilakukan penelusuran untuk semua bercak sekaligus. Sedangkan cara penelusuran vertikal, hanya dapat
dilakukan satu per satu. Pada penelusuran bercak horisontal dengan penelusuran beberapa bercak sekaligus hanya dapat dilakukan apabila bercak-bercak tesrsebut
benar-benar berada dalam satu baris. Cara ini akan mengalami kesulitan jika bercak yang sangat dekat dengan bercak yang akan ditetapkan, karena ada
kemungkinan bercak yang tidak diinginkan ikut tertetapkan Mintarsih, 1990. Penelusuran bercak akan mendapatkan hasil yang baik apabila dilakukan
pada panjang gelombang maksimum, karena perubahan konsentrasi pada bercak sedikit saja sudah terdeteksi. Pengukuran dilakukan dengan menelusuri bercak
yang akan ditetapkan kadarnya pada kisaran panjang gelombang zat tersebut Mintarsih, 1990.
Pelat yang digunakan untuk KLT pada densitometri sebaiknya digunakan pelat buatan pabrik, karena pada pelat buatan sendiri fase diamnya kurang rata,
sehingga akan mempengaruhi hasil penelusuran dengan densitometri, yaitu berupa puncak yang lebar dan kasar. Puncak yang lebar disebabkan kurang kompaknya
fase diam, puncak yang kasar disebabkan permukaan pelat kurang rata Mintarsih, 1990.
Ada dua cara penetapan dengan alat densitometer. Pertama, setiap kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan dielusi
bersama dalam satu lempeng, kemudian Area Under Curve AUC sampel dibandingkan dengan AUC zat baku. Yang kedua, dengan membuat kurva
hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku diperoleh dengan membuat totolan zat baku pada pelat KLT dengan bermacam-macam konsentrasi
minimal tiga macam konsentrasi. Bercak yang diperoleh dicari AUC dengan densitometer. Dari kurva baku diperoleh persamaan : y = bx + a, dimana x adalah
banyaknya zat yang ditotolkan dan y adalah AUC Supardjan, 2002.
H. Validasi Metode Analisis
1. Tinjauan Umum
Validasi metode menurut USP dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis bersifat akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang
akan dianalisis. Secara singkat, validasi merupakan aksi konfirmasi bahwa metode analisis yang akan digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan Rohman,
2009.
