Alat dan Bahan Cara Kerja
Berikut adalah dokumentasi pembuatan ekstrak daun Keji Beling Strobilanthes crispa Bl. :
a b
Gambar 3.1 Konsentrasi Ekstrak Daun a Sterilisasi Daun dengan Natrium Hipoklorit b
c. Pembuatan Media Uji Nutrient Agar NA
Pembuatan media uji Nutrient Agar NA dilakukan sesuai dengan takaran pada kemasan yaitu dengan mencampurkan 2 gram
NA dalam 100 ml aquades kemudian dipanaskan dengan Hot Plate Stirrer. Pengadukan dilakukan dengan magnetic strirrer. Media
NA bisa diangkat apabila sudah berwarna jernih. Selanjutnya media harus disterilkan dengan autoklaf. Media NA pada cawan
petri yang digunakan untuk menguji aktivitas antibakteri berisi masing-masing 10 ml. Sedangkan media pada agar miring untuk
meremajakan bakteri biakan murni yang digunakan sebagai media kultur bakteri masing-masing 5 ml Maria, 2011.
d. Penyiapan Mikroorganisme Uji
Pada mikroorganisme uji yang diperoleh dilakukan perbanyakan kultur murni. Kultur murni diambil menggunakan
jarum ose, kemudian digoreskan pada media agar miring secara aseptis. Setelah itu dilakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu
37,5 C Misnadiarly, Husjain. 2014. Sebelum digunakan untuk
menguji potensi daya hambat dari ekstrak daun Keji Beling, dilakukan pengenceran bertingkat pada kultur bakteri untuk
mengendalikan populasi bakteri. Satu ose biakan murni disuspensikan dengan 10 ml aquades steril pada tabung reaksi.
Tabung kedua berisi 9 ml aquades steril dan 1 ml suspensi yang diambil dari tabung pertama. Begitu seterusnya hingga
pengenceran 10
-7
cfumL. Suspensi bakteri pada pengenceran 10
-7
cfumL diinokulasikan dalam media NA padat dengan metode spread plate, sebanyak 0,3 ml suspensi bakteri diteteskan ke dalam
cawan petri berisi media NA, dan diratakan dengan trigalski Volk, 1993.
e. Uji Kemurnian Mikroorganisme Uji
Mikroorganisme uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Salmonella typhi.
1 Pengamatan Morfologi Koloni
Bentuk-bentuk koloni
bakteri digunakan
untuk mempermudah identifikasi dan determinasi suatu biakan
bakteri. Morfologi-morfologi koloni bakteri dapat dibedakan atas bentuk, ukuran, tekstur, warna koloni. Proses untuk
melihat morfologi koloni dalam media NA dalam cawan petri adalah dengan menginokulasikan 0,1 ml kultur bakteri dengan
memperhatikan pengenceran pada media NA dalam cawan petri secara spread plate kemudian diinkubasikan secara
terbalik pada suhu kamar selama 48 jam, kemudian amati pertumbuhan koloni bakteri tersebut Maria, 2011.
2 Pengamatan Morfologi Sel
Mikroorganisme uji diambil sebanyak satu ose, kemudian diinokulasikan secara goresan pada media NA miring dan
diinkubasi pada suhu 37,5 C selama 24 jam. Morfologi sel
mikroorganisme uji diamati dengan menggunakan pengecatan negatif, dimulai dengan membersihkan gelas benda dan gelas
penutup dengan alkohol, selanjutnya biakan mikroorganisme uji ambil sebanyak satu ose secara aseptis dan diletakkan di
atas gelas benda. Tinta cina diambil dan diteteskan pada salah satu ujung gelas benda kemudian gelas benda yang lain
diletakkan di atas suspensi dengan kemiringan 45 lalu ditarik
permukaannya dari ujung satu ke ujung lain hingga cat menjadi rata, sehingga menjadi lapisan tipis. Selanjutnya diamati di
bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100 dan dilakukan pengambilan gambar menggunakan optilab Alexander dkk,
2003
3 Pengecatan Gram
Proses pengecatan Gram dimulai dengan membuat sediaan bakteri Salmonella typhi pada gelas benda kemuadian ditetesi
kristal violet selama 1 menit, bilas dengan air mengalir selama 5 detik dan dikeringkan, kemudian tetesi lugol diamkan selama
1 menit, bilas dengan air mengalir selama 5 detik dan keringkan, setelah itu tetesi alkohol 96 dan diamkan selama
20 detik kemudian bilas dengan air mengalir diamkan selama 5 detik dan keringkan, terakhir tetesi safranin dan diamkan
selama 1 menit setelah itu bilas dengan air mengalir dan dikeringkan.
Hasil pewarnaan ditutup dengan gelas penutup dan ditetesi minyak emersi lalu diamati di bawah mikroskop dengan
perbesaran kuat, kemudian di foto dengan menggunakan optilab. Setelah diamati bakteri Gram positif akan berwarna
ungu dan bakteri Gram negatif akan berwarna merah Maria, 2011.
3. Tahap Perlakuan
a. Uji Aktivitas Antibakteri
Metode difusi spread plate secara aseptis digunakan untuk mengetahui aktivitas antibakteri. Media NA steril sebanyak 10 ml
dalam cawan petri diberikan suspensi bakteri sebanyak 0,3 ml. Bakteri yang dipakai adalah suspensi bakteri pada konsentrasi 10
-7
cfumL. Bakteri dimasukkan dalam media yang diratakan menggunakan trigalski. Perlakuan ini harus dilakukan secara
aseptis. Sebelumnya seluruh cawan petri dibagi menjadi 4 kuadran untuk digunakan sebagai pengulangan pada masing-masing
perlakuan yaitu pada konsentrasi 10, 25, 50, 75 dan 100. Selain itu disiapkan pula cawan petri yang dibagi menjadi 4
kuadran untuk kontrol kontrol positif kloramfenikol dan satu cawan petri untuk kontrol negatif aquades steril yang telah
dibagi dalam 4 kuadran. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah modifikasi Kirby-Bauer. Dalam Cappucino 2008
metode ini menggunakan paper disc atau cakram yang disterilkan. Paper disc steril yang telah direndam selama 48 jam dalam ekstrak
konsentrasi 10, 25, 50, 75 dan 100 dimasukkan ke dalam media yang sudah di inokulum menggunakan pinset. Selanjutnya
media tersebut diinkubasi selama 1 hari 24 jam dalam inkubator dengan suhu 37,5
C setelah itu dapat diamati dan diukur dengan penggaris diameter zona hambat disekitar paper disc tersebut.
Suhu 37,5 C tersebut merupakan suhu ideal untuk pertumbuhan
bakteri Salmonella typhi. Selama 24 jam karena sel bakteri diduga sudah dalam fase mati. Hasil dari terbentuknya zona hambat pada
pertumbuhan bakteri biasanya terlihat lebih bening daripada daerah sekitarnya. Ukuran zona hambat tergantung kepada kecepatan
difusi antimikroba, derajat sensitifitas, mikroorganisme dan kecepatan pertumbuhan bakteri Anonim, 2011. Keefektifan
ekstrak dapat dilihat dari zona hambat yang terbentuk.
b. Uji Kadar Hambat Minimal KHM
Penelitian ini
menggunakan metode
dilusi padat.
Konsentrasi ekstrak daun Keji Beling adalah 10, 25, 50 , 75, 100, ditambah 1 kontrol positif, 1 kontrol negatif dan
kontrol media. Konsentrasi minimal yang didapatkan dari uji
aktivitas digunakan sebagai acuan untuk menentukan konsentrasi yang akan digunakan dalam pengujian nilai KHM. Pada metode
dilusi padat, cara penanaman bakteri secara pourplate atau cawan tuang. Prosedur pourplate adalah dengan mendinginkan media
kultur yang sudah disterilkan dalam tabung reaksi sampai dengan suhu 45
C, kemudian dituangkan ke dalam cawan petri yang sudah berisi mikroba uji dan sampel ekstrak. Media kultur yang
digunakan adalah bakteri uji pada konsentrasi 10
-7
cfumL yang telah divortex sebelum diambil sebanyak 0,5 ml dan sampel
ekstrak juga diambil sebanyak 0,5 ml. Setelah pourplate dilakukan media kultur tersebut diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 37,5
C, penentuan nilai KHM dilihat dari konsentrasi terendah yang
medianya tidak ditumbuhi bakteri Idris, 2013.
c. Uji Kemampuan Bunuh Minimal KBM
Nilai KBM diperoleh dari media yang digunakan dalam uji KHM menggunakan metode streak dengan cotton bud steril.
Metode streak plate dilakukan dengan cara menggoreskan bakteri uji pada permukaan media agar menggunakan cotton bud yang
dibagi menjadi 3 kuadran, kerapatan goresan pada masing-masing kuadran berbeda berturut rapatnya mulai dari kuadran pertama
hingga kuadran ketiga. Setelah mendapatkan nilai KBM dipilih 2 konsentrasi
paling besar dalam uji KHM yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri, hal tersebut ditandai dengan media yang
tidak ditumbuhi oleh bakteri. Dua media paling jernih dibandingkan dengan menggoreskan cotton bud steril pada media
kultur baru kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 37,5
C, media kultur yang tidak ditumbuhi bakteri tersebutlah yang menjadi KBM.