Alat dan Bahan Cara Kerja

Berikut adalah dokumentasi pembuatan ekstrak daun Keji Beling Strobilanthes crispa Bl. : a b Gambar 3.1 Konsentrasi Ekstrak Daun a Sterilisasi Daun dengan Natrium Hipoklorit b c. Pembuatan Media Uji Nutrient Agar NA Pembuatan media uji Nutrient Agar NA dilakukan sesuai dengan takaran pada kemasan yaitu dengan mencampurkan 2 gram NA dalam 100 ml aquades kemudian dipanaskan dengan Hot Plate Stirrer. Pengadukan dilakukan dengan magnetic strirrer. Media NA bisa diangkat apabila sudah berwarna jernih. Selanjutnya media harus disterilkan dengan autoklaf. Media NA pada cawan petri yang digunakan untuk menguji aktivitas antibakteri berisi masing-masing 10 ml. Sedangkan media pada agar miring untuk meremajakan bakteri biakan murni yang digunakan sebagai media kultur bakteri masing-masing 5 ml Maria, 2011. d. Penyiapan Mikroorganisme Uji Pada mikroorganisme uji yang diperoleh dilakukan perbanyakan kultur murni. Kultur murni diambil menggunakan jarum ose, kemudian digoreskan pada media agar miring secara aseptis. Setelah itu dilakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu 37,5 C Misnadiarly, Husjain. 2014. Sebelum digunakan untuk menguji potensi daya hambat dari ekstrak daun Keji Beling, dilakukan pengenceran bertingkat pada kultur bakteri untuk mengendalikan populasi bakteri. Satu ose biakan murni disuspensikan dengan 10 ml aquades steril pada tabung reaksi. Tabung kedua berisi 9 ml aquades steril dan 1 ml suspensi yang diambil dari tabung pertama. Begitu seterusnya hingga pengenceran 10 -7 cfumL. Suspensi bakteri pada pengenceran 10 -7 cfumL diinokulasikan dalam media NA padat dengan metode spread plate, sebanyak 0,3 ml suspensi bakteri diteteskan ke dalam cawan petri berisi media NA, dan diratakan dengan trigalski Volk, 1993. e. Uji Kemurnian Mikroorganisme Uji Mikroorganisme uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Salmonella typhi. 1 Pengamatan Morfologi Koloni Bentuk-bentuk koloni bakteri digunakan untuk mempermudah identifikasi dan determinasi suatu biakan bakteri. Morfologi-morfologi koloni bakteri dapat dibedakan atas bentuk, ukuran, tekstur, warna koloni. Proses untuk melihat morfologi koloni dalam media NA dalam cawan petri adalah dengan menginokulasikan 0,1 ml kultur bakteri dengan memperhatikan pengenceran pada media NA dalam cawan petri secara spread plate kemudian diinkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 48 jam, kemudian amati pertumbuhan koloni bakteri tersebut Maria, 2011. 2 Pengamatan Morfologi Sel Mikroorganisme uji diambil sebanyak satu ose, kemudian diinokulasikan secara goresan pada media NA miring dan diinkubasi pada suhu 37,5 C selama 24 jam. Morfologi sel mikroorganisme uji diamati dengan menggunakan pengecatan negatif, dimulai dengan membersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan alkohol, selanjutnya biakan mikroorganisme uji ambil sebanyak satu ose secara aseptis dan diletakkan di atas gelas benda. Tinta cina diambil dan diteteskan pada salah satu ujung gelas benda kemudian gelas benda yang lain diletakkan di atas suspensi dengan kemiringan 45 lalu ditarik permukaannya dari ujung satu ke ujung lain hingga cat menjadi rata, sehingga menjadi lapisan tipis. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100 dan dilakukan pengambilan gambar menggunakan optilab Alexander dkk, 2003 3 Pengecatan Gram Proses pengecatan Gram dimulai dengan membuat sediaan bakteri Salmonella typhi pada gelas benda kemuadian ditetesi kristal violet selama 1 menit, bilas dengan air mengalir selama 5 detik dan dikeringkan, kemudian tetesi lugol diamkan selama 1 menit, bilas dengan air mengalir selama 5 detik dan keringkan, setelah itu tetesi alkohol 96 dan diamkan selama 20 detik kemudian bilas dengan air mengalir diamkan selama 5 detik dan keringkan, terakhir tetesi safranin dan diamkan selama 1 menit setelah itu bilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Hasil pewarnaan ditutup dengan gelas penutup dan ditetesi minyak emersi lalu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat, kemudian di foto dengan menggunakan optilab. Setelah diamati bakteri Gram positif akan berwarna ungu dan bakteri Gram negatif akan berwarna merah Maria, 2011. 3. Tahap Perlakuan a. Uji Aktivitas Antibakteri Metode difusi spread plate secara aseptis digunakan untuk mengetahui aktivitas antibakteri. Media NA steril sebanyak 10 ml dalam cawan petri diberikan suspensi bakteri sebanyak 0,3 ml. Bakteri yang dipakai adalah suspensi bakteri pada konsentrasi 10 -7 cfumL. Bakteri dimasukkan dalam media yang diratakan menggunakan trigalski. Perlakuan ini harus dilakukan secara aseptis. Sebelumnya seluruh cawan petri dibagi menjadi 4 kuadran untuk digunakan sebagai pengulangan pada masing-masing perlakuan yaitu pada konsentrasi 10, 25, 50, 75 dan 100. Selain itu disiapkan pula cawan petri yang dibagi menjadi 4 kuadran untuk kontrol kontrol positif kloramfenikol dan satu cawan petri untuk kontrol negatif aquades steril yang telah dibagi dalam 4 kuadran. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah modifikasi Kirby-Bauer. Dalam Cappucino 2008 metode ini menggunakan paper disc atau cakram yang disterilkan. Paper disc steril yang telah direndam selama 48 jam dalam ekstrak konsentrasi 10, 25, 50, 75 dan 100 dimasukkan ke dalam media yang sudah di inokulum menggunakan pinset. Selanjutnya media tersebut diinkubasi selama 1 hari 24 jam dalam inkubator dengan suhu 37,5 C setelah itu dapat diamati dan diukur dengan penggaris diameter zona hambat disekitar paper disc tersebut. Suhu 37,5 C tersebut merupakan suhu ideal untuk pertumbuhan bakteri Salmonella typhi. Selama 24 jam karena sel bakteri diduga sudah dalam fase mati. Hasil dari terbentuknya zona hambat pada pertumbuhan bakteri biasanya terlihat lebih bening daripada daerah sekitarnya. Ukuran zona hambat tergantung kepada kecepatan difusi antimikroba, derajat sensitifitas, mikroorganisme dan kecepatan pertumbuhan bakteri Anonim, 2011. Keefektifan ekstrak dapat dilihat dari zona hambat yang terbentuk. b. Uji Kadar Hambat Minimal KHM Penelitian ini menggunakan metode dilusi padat. Konsentrasi ekstrak daun Keji Beling adalah 10, 25, 50 , 75, 100, ditambah 1 kontrol positif, 1 kontrol negatif dan kontrol media. Konsentrasi minimal yang didapatkan dari uji aktivitas digunakan sebagai acuan untuk menentukan konsentrasi yang akan digunakan dalam pengujian nilai KHM. Pada metode dilusi padat, cara penanaman bakteri secara pourplate atau cawan tuang. Prosedur pourplate adalah dengan mendinginkan media kultur yang sudah disterilkan dalam tabung reaksi sampai dengan suhu 45 C, kemudian dituangkan ke dalam cawan petri yang sudah berisi mikroba uji dan sampel ekstrak. Media kultur yang digunakan adalah bakteri uji pada konsentrasi 10 -7 cfumL yang telah divortex sebelum diambil sebanyak 0,5 ml dan sampel ekstrak juga diambil sebanyak 0,5 ml. Setelah pourplate dilakukan media kultur tersebut diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 37,5 C, penentuan nilai KHM dilihat dari konsentrasi terendah yang medianya tidak ditumbuhi bakteri Idris, 2013. c. Uji Kemampuan Bunuh Minimal KBM Nilai KBM diperoleh dari media yang digunakan dalam uji KHM menggunakan metode streak dengan cotton bud steril. Metode streak plate dilakukan dengan cara menggoreskan bakteri uji pada permukaan media agar menggunakan cotton bud yang dibagi menjadi 3 kuadran, kerapatan goresan pada masing-masing kuadran berbeda berturut rapatnya mulai dari kuadran pertama hingga kuadran ketiga. Setelah mendapatkan nilai KBM dipilih 2 konsentrasi paling besar dalam uji KHM yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri, hal tersebut ditandai dengan media yang tidak ditumbuhi oleh bakteri. Dua media paling jernih dibandingkan dengan menggoreskan cotton bud steril pada media kultur baru kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 37,5 C, media kultur yang tidak ditumbuhi bakteri tersebutlah yang menjadi KBM.

E. Metode Analisis Data

Data awal yang didapat perlu dilakukan uji normalitas dan homogenitas. Uji normalitas dilakukan untuk mengetahui normalitas distribusi data, jika peneyebarannya tidak 100 normal, maka kesimpulan yang ditarik berkemungkinan salah Irianto, 2004. Uji homogenitas adalah perbandingan data yang sejenis. Analisa yang digunakan untuk uji normalitas, homogenitas dan mengetahui daya hambat ekstrak Keji Beling terhadap pertumbuhan bakteri Salmonella typhi dilakukan dengan uji statistik One Way Annova dengan tingkat kepercayaan 95. Penghitungan dilakukan dengan program SPSS versi 16.

F. Rancangan Pemanfaatan Hasil Penelitian Dalam Pembelajaran

Penelitian yang diperoleh diharapkan bermanfaat dalam pembelajaran Biologi khususnya pada materi Archaebacteria dan Eubacteria dengan sub bab materi Bakteri Dalam Kehidupan Manusia, kelas X semester 1, kurikulum 2013. Dengan penelitian ini siswa dapat mengetahui pengaruh faktor luar yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. 32

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Penelitian

1. Uji Kemurnian Bakteri Uji

Bakteri uji yang digunakan adalah Salmonella typhi. Uji kemurnian bakteri dilakukan agar didapatkan isolat bakteri yang murni. Uji kemurnian bakteri meliputi pengamatan morfologi sel, pengamatan morfologi koloni dan pengecatan Gram. Untuk lebih menyakinkan bahwa bakteri yang tumbuh adalah Salmonella typhi maka uji kemurnian dilakukan sebelum dan sesudah melakukan uji aktivitas antibakteri. Berdasarkan hasil uji sebelum gambar 4.2 a dan sesudah uji aktivitas antibakteri diketahui morfologi sel bakteri Salmonella typhi berbentuk batang pendek. Hal ini sesuai dengan pernyataan Misnadiarly dan Husjain 2014 yang mengatakan Salmonella typhi berbentuk batang pendek dengan diameter 0,5-0,8 µ dan panjang 1-3 µ. Hasil uji pada pengamatan morfologi koloni didapatkan bentuk koloni yang menyebar, bulat dan tidak berwarna Gambar 4.2 b. Hal tersebut senada dengan pernyataan Maksum 2010 yang mengatakan dalam media agar Salmonella-Shigella, agar endo, dan agar MacConkey, koloni Salmonella berbentuk bulat, kecil, dan tidak berwarna. Salmonella typhi termasuk Gram negatif yang berwarna merah setelah dilakukan pengecatan Gram karena Salmonella typhi mampu mengikat zat warna kedua yaitu safranin. Pengecatan Gram dilakukan sebelum Gambar 4.1 a dan sesudah Gambar 4.1 b uji aktivitas antibakteri. Hal ini sesuai dengan pernyataan Misnadiarly dan Husjain 2014 yang mengatakan Salmonella typhi adalah bakteri Gram-negatif yang berwarna merah setelah dilakukan pengecatan Gram dan dapat tumbuh pada suasana aerob dan aerob fakultatif. Berikut adalah dokumentasi hasil pengecatan Gram yang dilakukan sebelum dan sesudah uji aktivitas antibakteri : a b Gambar 4.1 Sebelum a dan Sesudah b a b Gambar 4.2 Uji Morfologi Sel a Uji Morfologi Koloni b

2. Hasil Pengukuran Daya Hambat Ekstrak Daun Keji Beling

Terhadap Pertumbuhan Salmonella typhi Hasil dari uji daya hambat ekstrak daun Keji Beling terhadap pertumbuhan Salmonella typhi dapat dilihat dalam tabel di bawah ini : Tabel 4.1 Pengukuran Diameter Hasil Uji Daya Hambat Ekstrak Kuadran Kontrol - 10 25 50 75 100 Kontrol + 1 Seluruh permuka- an media ditumbuhi bakteri 11 11 13 10 14 Seluruh permuka- an media tidak ditumbu- hi bakteri 2 7,5 11 6,5 12 15 3 10 12 13 9 4 9 9 12 13 14 Rata-rata 6,87 10,25 10,87 12 13 Keterang- an Tidak ada daya hambat Kuat Kuat Kuat Kuat Kuat Sangat Kuat Pengukuran berdasarkan mm a b c d e f g h Gambar 4.3 Kontrol – a, Konsentrasi 10 b, Konsentrasi 25 c, Konsentrasi 50 d, Konsentrasi 75 e, Konsentrasi 100 f, Kontrol + g dan Kontrol Media h