3 METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari-Desember 2010 bertempat di laboratorium Bioteknologi 2 dan laboratorium Biokimia, Departemen Teknologi
Hasil Perairan, FPIK, untuk kultivasi Spirulina fusiformis dan analisis kuantitatif pigmen fikosianin, laboratorium Fisika Instrumen FMIPA untuk pengujian
spektrum maksimum biopigmen, laboratorium imunologi, FKH, dan laboratorium Hewan Coba, Biokimia, FMIPA, Institut Pertanian Bogor, untuk uji kadar glukosa
darah tikus percobaan.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk kultivasi dan ekstraksi Spirulina fusiformis meliputi akuarium, toples kaca, neraca analitik, tube light TL Philips 40 watt,
freeze dryer, oven, desikator, lemari es, nylon mesh 20 µm, pH-meter, spektrofotometer UV-Vis 2800 dan USB 2000 dengan software Spectra Suite,
lux-meter, magnetic stirer serta sentrifuse. Alat untuk pemeliharaan tikus,
meliputi kandang plastik, botol minum, wadah pakan, timbangan, alat sonde syringe yang dilengkapi dengan jarum berujung bundar, glucose strip test, dan
glukosa meter OneTouchUltra. Bahan penelitian meliputi inokulum Spirulina fusiformis dari koleksi
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI, Cibinong, Bogor; media Zarouk teknis Lampiran 1 yang terdiri dari bahan-bahan berikut NaHCO
3
, KNO
3
, K
2
SO
4
, NaCl, FeCl
3
, Na
2
EDTA, serta trace element sebagai vitamin yang terdiri dari H
3
BO
3
, MnCl
2
.4H
2
O, ZnSO
4
.7H
2
O, Na
2
MoO
4
.2H
2
O, CuSO
4
.5H
2
O, COCl
2
.6H
2
O, Na
2
WO
4
.2H
2
O, NH
4
VO
3
, CaCl
2
, NiSO
4
.7H
2
O Borowitzka dan Borowitzka 1988. Bahan bahan kimia untuk analisis kadar fikosianin adalah
100 mM larutan buffer fosfat pH 7 yang dibuat dari K
2
HPO
4
, KH
2
PO
4
Lorenz 1998 dan akuades. Bahan untuk pengujian hewan percobaan, meliputi 30 ekor tikus jantan Sprague-dawley berumur 6-8 minggu, ransum standar,
sukrosa, tablet Glucobay, dan air mineral.
3.3 Tahapan Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dalam beberapa tahap meliputi kultivasi Spirulina fusiformis untuk memperoleh kurva pertumbuhan, produksi biomasa
untuk menentukan umur panen dengan kadar fikosianin tertinggi, ekstraksi fikosianin menggunakan air, serta pengukuran kadar glukosa darah dengan
Tes Toleransi Glukosa Oral untuk menguji aktivitas antihiperglikemik antara biomasa dan pigmen fikosianin yang dihasilkan terhadap tikus percobaan. Secara
umum tahapan penelitian ini disajikan pada Gambar 4.
Gambar 4 Diagram alir tahapan penelitian Inokulum
Spirulina Kultivasi dalam media Zarouk
Pencahayaan 24 jam Kultivasi 100 L
Penentuan kurva Pemanenan dan pengeringan
Uji aktivitas antihiperglikemik in vivo dengan tes toleransi glukosa oral pada hewan coba tikus
Serbuk fikosianin Supernatan
larutan fikosianin Ekstraksi
Biomasa kering
Pengeringan dengan freeze dryer
1 Kultivasi Spirulina fusiformis
Kurva Spirulina fusiformis diperoleh melalui kultivasi pada media Zarouk selama 90 hari. Spirulina yang akan diukur absorbansinya ditumbuhkan dalam
sebuah toples plastik berisi 3 liter media Zarouk dengan volume inokulum 30 ml. Selama periode kultur pencahayaan diatur sebesar 5500 lux dengan mendekatkan
akuarium pada sumber cahaya lampu kemudian diukur dengan lux meter, dan diberi aerasi udara. Sampling dilakukan setiap hari untuk dilihat kepadatannya.
Laju pertumbuhan Spirulina harian diukur berdasarkan kerapatan optik atau optical density OD dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 480 nm. Data absorbansi yang didapatkan diplotkan pada kurva pertumbuhan Achmadi et al. 2002.
2 Biomasa Spirulina fusiformis
Spirulina fusiformis dikultivasikan pada media Zarouk Borowitzka 1988 dan Muhammad 2007 dalam akuarium yang terdiri dari 100 L media dan
20 L inokulum dengan pencahayaan lampu 24 jam. Komposisi media Zarouk disajikan pada Lampiran 1.
Kultur Spirulina fusiformis dipanen pada awal dan akhir fase log, serta awal dan akhir fase stasioner. Pemanenan biomasa dapat dilakukan dengan teknik
filtrasi menggunakan kain nylon mesh ukuran 20 µm dan atau kain blacu.
Biomasa basah dikering anginkan menggunakan kipas angin pada suhu ruang ±28
o
C selama 5 jam agar tidak terjadi kerusakan akibat suhu, termasuk berkurangnya kadar fikosianin Mohammad 2007.
3 Ekstraksi fikosianin
Ekstraksi fikosianin dilakukan menggunakan air. Prosesnya adalah biomasa Spirulina yang telah dikeringkan disuspensikan ke dalam akuades, dibekukan
pada suhu -15
o
C selama ±48 jam, selanjutnya dilelehkan pada suhu 30
o
C selama satu jam dan diaduk menggunakan magnetic stirer. Sampel diusahakan tetap
disimpan pada suhu chilling ± 4
o
C sampai disentrifugasi pada 3000 rpm selama 30 menit dengan suhu 4
o
C Minkova et al. 2003. Masing-masing fikosianin yang diperoleh diukur kadarnya pada panjang
gelombang 620 nm menggunakan spektrofotometer. Biomasa kering dan
fikosianin dengan absorbansi tertinggi digunakan dalam tahap pengujian in vivo, terlebih dahulu fikosianin dikeringkan menggunakan freeze dryer.
4 Pengujian aktivitas antihiperglikemik dengan metode Tes Toleransi Glukosa Oral TTGO pada hewan coba Soetarno 1999
Bahan uji yang diberikan terhadap tikus percobaan pada penelitian ini adalah biomasa dan fikosianin yang diperoleh dari kultur Spirulina fusiformis dengan
umur panen 75 hari. Penggunaan dosis biomasa Spirulina fusiformis adalah berdasarkan hasil terbaik pada penelitian Mridha et al. 2010 yaitu 0,15 mgg BB
dan ditingkatkan menjadi 0,30 mgg BB. Dosis pemberian fikosianin juga sama dengan dosis pemberian biomasa.
Sukrosa yang diberikan mengacu pada penelitian Sugiwati 2005 yang menyatakan bahwa larutan sukrosa 80 bv mampu meningkatkan kadar glukosa
darah setelah 1 jam pemberian oral hingga 140 mgdl. Hal ini sesuai dengan pernyataan Gibney et al. 2008 bahwa hiperglikemia adalah kadar glukosa
≥126 mgdl setelah 1 jam pemberian oral sukrosa. Biomasa dan fikosianin yang digunakan terlebih dahulu dilarutkan dalam air
mineral. Dosis pemberian Spirulina fusiformis adalah berdasarkan dosis terbaik hasil penelitian Mridha et al. 2010, sedangkan obat Acarbose dengan merek
dagang Glucobay yang digunakan sebagai kontrol positif, diberikan atas dosis manusia dengan BB 50 kg Sugiwati S. 2005. Tikus yang digunakan adalah tikus
jantan jenis Sprague-Dawley berumur 6-8 minggu dengan bobot badan 180
– 200 g yang diperoleh dari Balai Veteriner, Bogor. Tikus diadaptasikan selama dua minggu sebelum melakukan percobaan,
fungsinya untuk menyeragamkan cara hidup dan makanannya. Tikus dipelihara dalam kandang plastik, satu kandang berisi satu ekor tikus. Pembersihan kandang
tikus setiap 3 hari sekali sedangkan pemberian pakan dan minum dilakukan setiap hari secara ad libitum tak terbatas.
Pengujian aktivitas antihiperglikemik dilakukan melalui Tes Toleransi Glukosa Oral Sugiwati S. 2005. Pada percobaan ini digunakan 30 ekor tikus
putih sehat yang dibagi menjadi 6 kelompok perlakuan dengan jumlah 5 ekor untuk setiap kelompok perlakuan, yaitu kelompok P, B1, B2, F1, F2, N, sebagai
berikut:
1 Kelompok perlakuan P kontrol positif
Pada kelompok perlakuan P, tikus dicekok obat Acarbose Glucobay dengan dosis 0,001 mgg BB tikus.
2 Kelompok perlakuan B1
Pada kelompok B1, tikus dicekok biomasa kering Spirulina fusiformis dengan dosis 0,15 mgg BB tikus
3 Kelompok perlakuan B2
Pada kelompok B2, tikus dicekok biomasa kering Spirulina fusiformis dengan dosis 0,30 mgg BB tikus
4 Kelompok perlakuan F1
Pada kelompok F1, tikus dicekok fikosianin kering dengan dosis 0,15 mgg BB tikus
5 Kelompok perlakuan F2
Pada kelompok F2, tikus dicekok fikosianin kering dengan dosis 0,30 mgg BB tikus
6 Kelompok perlakuan N kontrol negatif
Pada kelompok N, tikus dicekok larutan sukrosa 80 bv sebanyak 1 ml Sebelum pengujian, tikus dipuasakan selama 18 jam dengan tetap pemberian
minum. Semua tikus pada masing-masing kelompok diambil darah untuk diukur kadar glukosa darah puasanya. Langkah selanjutnya adalah pada kelompok P
kontrol positif, B1, B2, F1, F2, dicekok bahan perlakuan yang dilarutkan terlebih dahulu dalam 2 ml air mineral.
Selang waktu 5 menit setelahnya, pada masing-masing kelompok P, B1, B2, F1, F2, dicekok dengan 1 ml larutan sukrosa 80 bv, sedangkan kelompok N
kontrol negatif hanya dicekok dengan larutan sukrosa 80 bv. Pencekokan larutan dilakukan menggunakan alat sonde dan syringe steril. Selanjutnya, kadar
glukosa darah pada masing-masing kelompok diukur setelah ½, 1, 2, dan 3 jam setelah perlakuan.
3.4 Prosedur Analisis
Kategori