Diagnosis pasti untuk infeksi dengue didapatkan dari hasil isolasi virus dengue melalui kultur virus atau dengan deteksi antigen virus RNA dengue dengan teknik
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction RT-PCR Suhendro et al, 2006; Soegijanto, 2006.
II.7. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction RT-PCR
PCR ditemukan pertama kali oleh Kary Mulis pada tahun 1985, suatu prosedur yang efektif untuk pelipatgandaaan sekuen DNA target dan dapat memperoleh 10
6
- 10
9
kali jumlah DNA target awal. Proses pelipatgandaan ini dikenal dalam istilah biologi molekuler sebagai amplifikasi DNA.
RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR, dimana yang diamplifikasi berupa m- RNA. Mula-mula RNA diubah dulu menjadi DNA dengan menggunakan reverse
transcriptase yang dapat mensintesis DNA dengan cetakan RNA dan menghasilkan DNA yang dikenal dengan nama cDNA complement DNA. Hanya enzim jenis ini
yang dapat mensintesis DNA dengan cetakan RNA karena polimerase DNA hanya dapat mensintesis dengan menggunakan cetakan DNA. Setelah DNA terbentuk, maka
DNA itu dapat diamplifikasi seperti umumnya proses pada PCR. Jadi, RT-PCR digunakan untuk mengamplifikasi RNA yang kestabilannya jauh lebih rendah
dibandingkan DNA Sudjadi, 2008.
41
RNA merupakan asam ribonukleat utas tunggal, sedangkan DNA adalah asam ribonukleat utas ganda. Ciri khas RNA adalah tidak terdapatnya gugus nukleotida
Timin T tetapi diganti dengan Urasil U. Oleh karena itu dalam proses RT-PCR akan disintesis cDNA dari pasangan antara gugus basa Urasil U dan Adenin A
serta Guanin G dengan Sitosin C. Proses amplifikasi PCR meliputi 3 tahapan proses utama yaitu :
1. Denaturasi denaturation, yaitu pelepasan utas ganda DNA menjadi utas tunggal
DNA . 2.
Annealing, yaitu pemasangan 2 utas primer pada kedua utas tunggal DNA tersebut. Primer digunakan sebagai pancingan awal untuk melipatgandakan
segmen DNA. Umumnya primer terdiri dari 18-24 deret basa nukleotida pengkode DNA yang disintesis secara buatan dan biasanya dapat dipasangkan
dengan DNA yang akan dideteksi. 3.
Extension atau perpanjangan, yaitu deoxyribonucleatide triphosphate dNTP yang sebelumnya telah ditambahkan dalam reaksi akan menyebabkan primer
memperoleh tambahan basa nukleotida, dan kemudian akan menjadi sepanjang segmen DNA yang dilipatgandakan itu.
Pada RT-PCR, disebabkan adanya penambahan proses sintesis cDNA maka pada tahap pertama tidak dilakukan lebih dulu denaturasi tetapi annealing. Hal ini
bertujuan untuk memasangkan primer untuk membentuk molekul cDNA. Setelah terbentuk cDNA, baru kemudian masuk pada reaksi PCR biasa Sopian, 2006.
42
RT-PCR penting digunakan sebagai alat diagnostik untuk mendeteksi dan menentukan serotipe virus Dengue terutama pada tubuh nyamuk karena dapat
mendeteksi dini serotipe virus dan sebagai informasi untuk studi epidemiologi. Selain itu teknik ini relatif lebih murah dengan sensitivitas dan sensitifitas yang tinggi
Harris et al., 1998.
43
44
BAB III METODE PENELITIAN
III.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan dengan cara mengambil sampel nyamuk A. aegypti betina dari rumah-rumah penduduk daerah endemik DBD di kota Medan, Sumatera Utara
dari bulan September sampai Oktober 2008. Wilayah tempat pengambilan sampel terdiri dari 5 kecamatan yaitu Medan Helvetia, Medan Selayang, Medan Sunggal,
Medan Baru dan Medan Amplas. Sampel kemudian diperiksa di SMF Laboratorium Mikrobiologi Klinik Rumah Sakit Umum Pusat RSUP Haji Adam Malik Medan
dengan menggunakan metode Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction RT-PCR.
III.2. Subjek Penelitian
Nyamuk A. aegypti betina yang didapat dari dalam dan sekitar rumah-rumah penduduk penderita DBD di kota Medan yaitu Kecamatan Medan Helvetia, Medan
Selayang, Medan Sunggal, Medan Baru, dan Medan Amplas.
III.3. Perkiraan Besar Sampel
Z
2
0,5 – 2.p.q n
≥ e
2
Keterangan : n = besar sampel Z
0,5 –
2, dengan = 0,05 å 1,96
p = proporsi = 50 = 0,5 q = 1-p = 0,5
