Pembuatan Simplisia Daun Pugun Tanoh Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Pugun Tanoh Karakterisasi dan Skrining Fitokimia Ekstrak Analisis Statistika

26 0,5 N, kalium iodida, α-naftol, asam sulfat pekat Merck, kristal natrium hidroksida Univar, timbal II asetat, besi III klorida, asam asetat anhidrida, toluen, kloroform, asam klorida 2 N, asam klorida pekat, asam klorida encer, serbuk magnesium, serbuk seng, iodium, metanol, etil asetat, kloroform, isopropanol, eter, kloralhidrat, air suling, Tween 80, natrium klorida 0,9 Widatarabakti dan baku albendazole PT. Indofarma.

3.2 Penyiapan Sampel

Penyiapan sampel meliputi pengambilan sampel dan identifikasi sampel.

3.2.1 Pengambilan sampel

Pengambilan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan bahan yang sama dari daerah lain. Tumbuhan pugun tanoh diambil dari Pajak Pancur Batu, Deli Serdang, Provinsi Sumatera Utara Bagian tanaman yang digunakan adalah daun. Hewan percobaan cacing tanah diambil dari Taman Obat Tradisional, Fakultas Farmasi, Jl. Tri Dharma, Pintu 4 Kampus USU, Medan, Provinsi Sumatera Utara.

3.2.2 Identifikasi sampel

Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor Ramadhani, 2014. Spesimen hewan percobaan diidentifikasi oleh Laboratorium Taksonomi Hewan Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam USU.

3.3 Pembuatan Simplisia Daun Pugun Tanoh

Daun pugun tanoh dipetik dan disortir kemudian dicuci hingga bersih, ditiriskan dan ditimbang. Daun pugun tanoh dikeringkan dalam lemari pengering Universitas Sumatera Utara 27 pada suhu 30-35ºC untuk memperoleh simplisia. Simplisia yang telah kering ditimbang kemudian diblender menjadi serbuk hingga agak halus lalu dimasukkan ke dalam wadah tertutup dan disimpan pada suhu kamar. 3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi Mayer Sebanyak 1,4 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10 l ml air suling. Kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Ditjen POM., 1995.

3.4.2 Pereaksi Dragendorff

Sebanyak 0,8 g bismut III dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat. Pada wadah lain, sebanyak 27,2 g kalium iodida dilarutkan dalam 50 ml air suling. Kedua larutan kemudian dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan air suling hingga volume larutan 100 ml Ditjen POM., 1995.

3.4.3 Pereaksi Bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium kemudian ditambahkan air suling hingga larutan 100 ml Ditjen POM., 1995.

3.4.4 Pereaksi Liebermann-Burchard

Sebanyak 5 bagian volume asam sulfat pekat dicampurkan dengan 50 bagian volume etanol 96. Kemudian ditambahkan dengan hati-hati 5 bagian volume asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut dan dinginkan Ditjen POM., 1995. Universitas Sumatera Utara 28

3.4.5 Pereaksi Molisch

Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N dan dicukupkan hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.

3.4.6 Pereaksi asam klorida 2 N

Sebanyak 17 ml larutan asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen POM., 1995.

3.4.7 Pereaksi asam sulfat 2 N

Sebanyak 5,4 ml larutan asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling sampai 100 ml Ditjen POM., 1995.

3.4.8 Pereaksi natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dengan air suling sebanyak 100 ml Ditjen POM., 1995.

3.4.9 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g timbal II asetat dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida sebanyak 100 ml Ditjen POM., 1995.

3.4.10 Pereaksi besi III klorida 1 bv

Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air secukupnya dan diencerkan hingga 100 ml Ditjen POM., 1995.

3.5 Karakterisasi Simplisia Daun Pugun Tanoh

Karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan organoleptik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut dalam air, penetapan kadar sari larut dalam etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu tidak larut asam. Universitas Sumatera Utara 29

3.5.1 Pemeriksaan organoleptik

Pemeriksaan organoleptik dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari simplisia dan ekstrak etanol daun pugun tanoh, yaitu warna, bau, bentuk dan rasa.

3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia daun pugun tanoh. Serbuk simplisia daun pugun tanoh ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop.

3.5.3 Penetapan kadar air

Sebanyak 200 ml toluen dimasukkan ke dalam labu alas bulat, lalu ditambahkan 2 ml air suling, setelah alat dipasang, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama ± 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Labu berisi toluen tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit kemudian setelah toluen mendidih, kecepatan toluen diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik. Air terdestilasi seluruhnya, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar, setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kadar air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO., 2011. Universitas Sumatera Utara 30

3.5.4 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dimasukkan ke dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus porselin dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 500-600°C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO., 2011.

3.5.5 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam

Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 l ml asam klorida encer selama 5 menit. Bagian yang tidak larut asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dan dipijar sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan WHO., 2011.

3.5.6 Penetapan kadar sari larut dalam air

Sebanyak 5 g serbuk simplisia daun pugun tanoh, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dilarutkan di dalam 1 L air suling dalam labu tersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI., 1995.

3.5.7 Penetapan kadar sari larut dalam etanol

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali Universitas Sumatera Utara 31 selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C sampai diperoleh bobot konstan. Kadar sari yang larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM., 1995.

3.6 Skrining Fitokimia Simplisia Daun Pugun Tanoh

Skrining fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloid, flavonoid, tanin, glikosida, saponin dan steroidtriterpenoid.

3.6.1 Pemeriksaan alkaloida Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan

9 o ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit. Setelah dingin lalu disaring dan filtrat digunakan untuk percobaan berikut: a. filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereaksi Mayer akan terbentuk endapan berwarna putih atau kuning menunjukkan reaksi positif; b. filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Bouchardat akan terbentuk endapan berwarna coklat-hitam menunjukkan reaksi positif; c. filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Dragendorff akan terbentuk endapan berwarna merah atau jingga menunjukkan reaksi positif. Alkaloida dinyatakan positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua atau tiga dari percobaan di atas Ditjen POM., 1995.

3.6.2 Pemeriksaan flavonoida

Larutan Percobaan: Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml metanol lalu direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring berlipat, Universitas Sumatera Utara 32 filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin ditambah 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, didiamkan. Lapisan metanol diambil, diuapkan pada temperatur 40 o C. Sisa dilarutkan dalam 5 ml etil asetat, disaring. Cara Percobaan : a. 1 ml larutan percobaan diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan dalam 1-2 ml etanol 96, ditambahkan 0,5 g serbuk seng dan 2 ml asam klorida 2 N, didiamkan selama satu menit. Ditambahkan 10 ml asam klorida pekat, jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoida glikosida-3-flavonol. b. 1 ml larutan percobaan diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan dalam 1 l ml etanol 96, ditambahkan 0,1 g magnesium dan 10 ml asam klorida pekat, terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoida Ditjen POM., 1995.

3.6.3 Pemeriksaan tanin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring. Filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Ke dalam 2 ml filtrat ditambahkan 1-2 tetes larutan besi III klorida. Jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966.

3.6.4 Pemeriksaan glikosida

Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol 96 dan 3 bagian volume air suling. Selanjutnya ditambahkan 10 l ml HCl 2 N, direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Pada 30 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat disari sebanyak 3 kali, tiap kali dengan 20 ml campuran 3 bagian volume kloroform dan 2 bagian volume Universitas Sumatera Utara 33 isopropanol. Lapisan air diambil kemudian ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch, ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat. Jika terbentuk cincin warna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya ikatan gula Ditjen POM., 1995.

3.6.5 Pemeriksaan saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Timbulnya busa yang mantap setinggi 1-10 cm tidak kurang dari 10 menit yang tidak hilang dengan penambahan 1 tetes larutan asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Ditjen POM., 1995.

3.6.6 Pemeriksaan steroida triterpenoida

Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Sisa dalam cawan penguap ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbulnya warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi hijau biru menunjukkan adanya steroidatriterpenoida Harborne, 1987.

3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Pugun Tanoh

Serbuk simplisia diekstraksi secara sokletasi dengan menggunakan pelarut etanol 96. Alat sokletasi dipasang, kemudian sebanyak 40 g serbuk simplisia daun pugun tanoh [ Curanga fel-terrae Lour. Merr.] dibungkus dengan kertas saring kemudian dimasukkan ke dalam alat soklet. Pelarut etanol 96 sebanyak 400 ml dimasukkan ke dalam labu alas bulat dan dipanaskan pada suhu 80°C sampai tetesan siklus mendekati tidak berwarna tersari sempurna selama 18 jam. Filtrat kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 50°C dan Universitas Sumatera Utara 34 diuapkan dengan penangas air kemudian dimasukkan ke dalam pendingin sehingga diperoleh ekstrak etanol daun pugun tanoh.

3.8 Karakterisasi dan Skrining Fitokimia Ekstrak

Karakterisasi dan skrining fitokimia ekstrak dilakukan dengan prosedur yang sama dengan karakterisasi dan skrining fitokimia pada simplisia daun pugun tanoh. 3.9 Uji Aktivitas Antelmintik Ekstrak Etanol Daun Pugun Tanoh 3.9.1 Hewan percobaan Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah cacing tanah dewasa Pheretima posthuma dengan ukuran seragam panjang 14 – 14,5 cm dan lebar 0,1 – 0,2 cm. Pheretima posthuma dikumpulkan dari tanah yang lembab, dicuci dengan air suling untuk menghilangkan pengotor dan diaklimasi dalam larutan salin selama 60 menit Joseph, et al., 2013.

3.9.2 Uji pengaruh etanol terhadap

Pheretima posthuma Larutan etanol 96 diencerkan dengan salin hingga 20 ml untuk memperoleh larutan etanol 0,5; 1; 2; 4; 6; 8 dan 10. Perhitungan pengenceran larutan etanol dapat dilihat pada Lampiran 20 halaman 59. Pheretima posthuma dimasukkan secara terpisah ke dalam cawan petri yang masing-masing berisi larutan etanol dengan konsentrasi berbeda tersebut. Efek etanol terhadap Pheretima posthuma diamati selama 5 jam.

3.9.3 Penyiapan sampel uji

Ditimbang 100, 200, 400 dan 600 mg ekstrak etanol daun pugun tanoh, kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam vial yang sudah dikalibrasi 20 Universitas Sumatera Utara 35 ml. Ekstrak dilarutkan dengan etanol 0,5 dan diencerkan sampai garis tanda. Albendazole disiapkan dengan mensuspensikan 1200 mg serbuk albendazole dalam lumpang yang berisi sejumlah larutan salin, lalu digerus. Sebanyak 0,3 ml Tween 80 ditambahkan ke dalam lumpang, kemudian digerus sampai terbentuk suspensi merata. Suspensi dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer yang sudah ditara, kemudian dicukupkan dengan larutan salin sampai 60 ml sehingga diperoleh suspensi albendazole dengan konsentrasi 20 mgml. Perhitungan penyiapan suspensi ekstrak dan albendazole dapat dilihat pada Lampiran 22 halaman 61.

3.9.4 Uji aktivitas antelmintik

Uji aktivitas antelmintik dilakukan berdasarkan prosedur Patilaya dan Husori 2015. Hewan percobaan dibagi menjadi 7 kelompok yang masing- masing terdiri dari 3 ekor cacing Pheretima posthuma dengan perlakuan seperti pada Tabel 3.1. Tabel 3.1. Perlakuan uji antelmintik ekstrak etanol daun pugun tanoh terhadap Pheretima posthuma Keterangan: EEDPT = ekstrak etanol daun pugun tanoh Seluruh perlakuan dilakukan dalam cawan petri steril pada suhu kamar. Aktivitas antelmintik ekstrak daun pugun tanoh ditentukan berdasarkan waktu paralisis dan kematian melalui pengamatan terhadap motilitas dan morfologi cacing Pheretima posthuma selama 5 jam. Cacing Pheretima posthuma Kelompok Perlakuan I Pemaparan dalam 20 ml larutan salin steril kontrol negatif II Pemaparan dalam 20 ml larutan etanol 0,5 kontrol pelarut III Pemaparan dalam 20 ml suspensi albendazole 20 mgml kontrol positif IV Pemaparan dalam 20 ml larutan EEDPT 5 mgml V Pemaparan dalam 20 ml larutan EEDPT 10 mgml VI Pemaparan dalam 20 ml larutan EEDPT 20 mgml VII Pemaparan dalam 20 ml larutan EEDPT 30 mgml Universitas Sumatera Utara 36 dipindahkan ke dalam cawan petri berisi larutan salin bersuhu 40-50 ºC untuk memastikan hewan percobaan telah mati,.

3.10 Analisis Statistika

Data-data hasil penelitian disajikan dalam nilai rata-rata ± simpangan baku. Analisis statistika dilakukan menggunakan perangkat lunak SPSS versi 22.0 dengan metode analisis variansi Anava satu arah, apabila terdapat perbedaan signifikan, analisis dilanjutkan dengan uji Tukey. Analisis statistika dilakukan pada taraf kepercayaan 95. Universitas Sumatera Utara 37

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Identifikasi Tumbuhan

Hasil identifikasi tumbuhan yang dilakukan oleh Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor menyebutkan bahwa tumbuhan yang digunakan adalah pugun tanoh [ Curanga fel-terrae Lour. Merr.] suku Scrophulariaceae Lampiran 1 halaman 56. Pada penelitian ini bagian tumbuhan pugun tanoh yang digunakan adalah daun. Lampiran 4 halaman 62 menunjukkan bahwa secara visual daun pugun tanoh yang segar berwarna hijau muda sampai hijau tua, berbentuk bulat telur dengan tinggi 2-7 cm dan lebar 2-4 cm, ujung daun agak melancip, tepi daun beringgit dan permukaan daun bertekstur kasar. Daun terasa sangat pahit di lidah dan bila diremas daunnya tidak mengeluarkan bau. Hasil yang sama juga dilaporkan oleh Patilaya dan Husori 2015, Ramadhani 2014, Harahap, dkk. 2013, Fithra 2013 dan Juwita 2009.

4.2 Karakteristik Simplisia Daun Pugun tanoh

Hasil penelitian menunjukkan bahwa secara organoleptik simplisia daun pugun tanoh berwarna hijau Lampiran 5 halaman 61. Simplisia daun pugun tanoh berasa pahit dan tidak berbau. Hasil yang sama juga dilaporkan oleh Patilaya dan Husori 2015, Ramadhani 2014, Fithra 2013 dan Juwita 2009. Hasil pemeriksaan mikroskopik simplisia daun pugun tanoh dapat dilihat pada Lampiran 6 halaman 62. Daun pugun tanoh memiliki fragmen pengenal seperti trikoma, tulang daun, berkas pembuluh, rambut bersel banyak, kristal Universitas Sumatera Utara