suatu senyawa menjadi berwarna. Warna dapat cepat kembali seperti semula karena di udara terdapat banyak uap air H-OH yang akan memberikan H pada O
yang kelebihan elektron sehingga reaksi kembali seperti semula reversible. Dengan melihat data perubahan warna pada ketiga bercak dan
dibandingkan menurut acuan Markham, 1988, dapat dinyatakan bahwa ketiga bercak tersebut merupakan senyawa flavonoida.
E. Isolasi Flavonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
KLTP
Isolasi flavonoida secara KLTP dengan cara menotolkan ekstrak metanol herba pegagan embun berupa pita memanjang. Fase diam yang digunakan adalah
selulosa dan fase geraknya adalah BAW. Pada KLTP ini dihasilkan 3 bercak pemisahan, 2 dari 3 bercak tersebut yang memiliki intensitas warna yang kuat
dikerok dan dilarutkan dalam metanol yang kemudian disebut isolat I untuk bercak dengan Rf 0,76 dan isolat II untuk bercak dengan Rf 0,90.
Kedua isolat tersebut selanjutnya diperiksa kemurniannya dengan kromatografi lapis tipis multi eluen KLT multi eluen. KLT multi eluen
merupakan KLT dengan menggunakan lebih dari satu fase gerak. Fase diam yang digunakan adalah selulosa dengan fase gerak BAW dan asam asetat 15 yang
dideteksi dengan sinar UV 365 nm. Dari KLT multi eluen isolat I dengan fase gerak BAW tampak 1 bercak
dengan Rf 0,73, sedangkan dari KLT multi eluen dengan fase gerak asam asetat 15 tampak 2 bercak dengan Rf 0,39 dan 0,86. Jadi, diketahui bahwa isolat I
44 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
belum murni. Dan selanjutnya dari KLT multi eluen isolat II diperoleh hasil yang sama dengan KLT multi eluen isolat I, yaitu dengan fase gerak BAW tampak 1
bercak dengan Rf 0,90 dan dengan fase gerak asam asetat 15 tampak 2 bercak dengan Rf 0,55 dan 0,80. Jadi, diperoleh hasil bahwa kedua isolat belum murni
sehingga perlu dilakukan reisolasi. Karena diketahui bahwa KLT multi eluen untuk kedua isolat dengan fase
gerak asam asetat 15 menghasilkan 2 bercak, sedangkan dengan fase gerak BAW hanya menghasilkan 1 bercak maka untuk reisolasi dengan KLTP
digunakan fase gerak asam asetat 15 dengan fase diam yang sama, yaitu selulosa. Dari KLTP isolat I diperoleh 3 pita pemisahan yaitu pita dengan Rf 0,36
isolat a berwarna ungu; Rf 0,77 isolat b dan 0,86 isolat c berwarna biru. Sedangkan dari KLTP isolat II diperoleh 3 pita pemisahan yaitu pita dengan Rf
0,50 isolat d berwarna ungu; Rf 0,73 isolat e dan 0,86 isolat f berwarna biru. Setiap pita pemisahan masing-masing isolat dikerok dan hasil kerokan dari pita
dengan warna dan Rf yang hampir sama dicampur, yaitu isolat b dengan isolat e dan isolat c dengan isolat f. Sehingga, didapatkan 4 isolat yaitu isolat a A, isolat
campuran b dan e B, isolat campuran c dan f C, dan isolat d D. Selanjutnya setiap isolat dilarutkan dalam metanol dan dianalisis lagi kemurniannya dengan
KLT multi eluen. Isolat tersebut selanjutnya akan digunakan untuk pemeriksaan kemurnian
dengan KLT multi eluen, untuk reaksi warna dan untuk pemeriksaan spektrofotometri UV.
45 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
F. Pemeriksaan Kemurnian Isolat
