BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian non eksperimental yang dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata
Dharma, Yogyakarta.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian
a. Variabel terkendali : sumber tumbuhan, pengumpulan tumbuhan, pengeringan, pembuatan serbuk, proses penyarian flavonoida dan bahan-
bahan pereaksi yang digunakan. b. Variabel tak terkendali : kondisi fisiologis tumbuhan dan kondisi tempat
tumbuh.
2. Definisi operasional
a. Isolasi flavonoida herba pegagan embun adalah proses pengambilan senyawa
flavonoida dari herba pegagan embun dengan maserasi dan dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis preparatif KLTP.
b. Identifikasi senyawa flavonoida adalah uji kualitatif untuk mengetahui
prakiraan struktur parsial senyawa flavonoida dalam herba pegagan embun secara kromatografi lapis tipis KLT, reaksi warna dan spektrofotometri
ultraviolet.
29 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
c. Simplisia herba pegagan embun adalah seluruh bagian tumbuhan pegagan
embun yang ada di atas permukaan tanah yang telah dikeringkan dengan cara
diangin-anginkan.
d. Maserasi adalah cara penyarian sederhana yang dilakukan dengan merendam
serbuk simplisia ke dalam cairan penyari yaitu campuran metanol : air dengan perbandingan 9 : 1 dan 1 : 1 yang disimpan selama 6-12 jam
dengan digojog pada shaker.
C. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian
a. Bahan tumbuhan yang digunakan adalah herba pegagan embun. b. Semua bahan kimia yang digunakan berderajat p.a pro analysis, produk
Merck kecuali dinyatakan lain. Bahan yang diperlukan dalam penelitian : metanol, n-butanol, asam asetat,
amonia pekat, aluminium klorida, magnesium, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, natrium hidroksida, natrium asetat anhidrat, asam borat.
2. Alat penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian : spektrofotometer UVvis model Genesys 6 split beam, lampu UV 365 nm, oven, blender, ayakan, kertas saring,
vakum rotaevaporator, penangas air, vakum, shaker, alat-alat gelas corong pisah, pipet tetes, gelas ukur, Beaker glass, corong, pengaduk, plat tetes,
Erlenmeyer, labu alas bulat, pipet kapiler, alat penyemprot bercak, sintered glass, gelas arloji, pipet ukur, flakon, cawan porselen.
30 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
D. Tata Cara Penelitian 1.
Determinasi tumbuhan pegagan embun
Determinasi terhadap tumbuhan pegagan embun dilakukan dengan menggunakan kunci determinasi tanaman Backer dan Bakhuizen Van den
Brink Jr.; 1963, 1965.
2. Pengumpulan bahan
Bahan berupa herba yang diperoleh dari lingkungan kampus Universitas Sanata Dharma, Paingan dikumpulkan pada bulan Januari tahun
2006.
3. Pembuatan serbuk simplisia
Herba tumbuhan pegagan embun terlebih dahulu dibersihkan dari debu dan kotoran pada air mengalir. Kemudian herba dikeringkan dengan diangin-
anginkan. Herba dinyatakan kering apabila ketika diremas mudah hancur. Herba yang telah kering tersebut diserbuk dengan menggunakan blender
kemudian diayak. Serbuk disimpan dalam plastik hitam yang diikat rapat.
4. Penyarian flavonoida
Bahan yang telah diserbuk dan diayak, ditimbang sebanyak 20 gram. Penyarian dilakukan dengan cara maserasi. Proses maserasi dilakukan dengan
merendam serbuk menggunakan campuran pelarut pertama yaitu metanol : air 9 : 1 sebanyak 150 ml. Campuran digojog dengan shaker selama 6-12 jam, di
tempat yang terlindung cahaya pada suhu kamar. Untuk pemisahan serbuk dan cairan hasil penyarian, dilakukan penyaringan menggunakan kertas saring.
Bagian serbuk disari lagi dengan pelarut metanol : air 1 : 1 sebanyak 150 ml,
31 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas. Kedua hasil penyarian dicampur, diuapkan dengan vakum rotaevaporator hingga tinggal sepertiga atau
metanolnya hampir menguap semua. Pelarut yang masih tersisa diuapkan pada oven.
5. Pemeriksaan pendahuluan flavonoida dengan KLT
Pemeriksaan flavonoida dilakukan terhadap ekstrak metanol secara KLT dengan menggunakan fase diam selulosa dan fase gerak BAW n-butanol :
asam asetat : air = 4 : 1 : 5, fase atas. Ekstrak metanol ditotolkan pada lempeng selulosa, kemudian dikembangkan dengan jarak pengembangan 10 cm dari
totolan. Pemisahan bercak yang didapat pada kromatogram dideteksi dengan menggunakan lampu UV 365 nm, sebelum dan sesudah diuapi amonia warna
reversible.
6. Isolasi flavonoida dengan KLTP
Isolasi dengan KLTP dilakukan dengan fase diam selulosa dan fase gerak BAW. Ekstrak metanol ditotolkan berupa garis yang selanjutnya
dikembangkan dengan jarak pengembangan 10 cm dari totolan, dan didapatkan bercak pemisahan berupa pita. Pita yang diduga sebagai flavonoida dikerok,
dimasukkan ke dalam Beaker glass dan dilarutkan dengan metanol. Selanjutnya dilakukan penyaringan dengan menggunakan sintered glass dan disedot dengan
vakum. Filtrat yang didapat dikeringkan dan kemudian ditimbang. Dilakukan reisolasi dengan fase diam selulosa dan fase gerak asam asetat 15 . Reisolasi
dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas. Isolat flavonoida yang
32 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
diperoleh digunakan untuk dianalisis dengan KLT multi eluen, reaksi warna dan spektrofotometri UV. Sisa serbuk disimpan.
7. Pemeriksaan kemurnian isolat
Kemurnian isolat flavonoida dapat diketahui menggunakan KLT multi eluen. KLT ini menggunakan fase gerak pertama BAW dan fase gerak kedua
asam asetat 15 dengan fase diam selulosa. Jika hasil dari kedua fase gerak tersebut adalah bercak tunggal maka dapat disimpulkan bahwa isolat flavonoida
tersebut sudah murni.
8. Reaksi warna flavonoida
Isolat flavonoida hasil pemisahan dianalisis dengan uji reaksi warna : a.
Tiga tetes larutan isolat pada plat tetes ditambah dengan 1 tetes larutan NaOH 1 Larutan NaOH 1 dibuat dengan melarutkan 1 g NaOH dalam
air bebas CO
2
hingga 100 ml. Warna yang terjadi dicatat. b.
Tiga tetes larutan isolat pada plat tetes ditambah dengan 1 tetes larutan H
2
SO
4
pekat. Warna yang terjadi dicatat. c.
Tiga tetes larutan isolat pada plat tetes ditambah sedikit serbuk Mg dan 2 tetes HCl pekat. Warna yang terjadi dicatat.
9. Identifikasi senyawa flavonoida dengan spektrofotometri ultraviolet
Mabry, Markham, Thomas, 1970
Identifikasi dan penentuan struktur parsial isolat flavonoida dilakukan dengan metode spektrofotometri UV dengan melarutkan isolat dalam metanol
dan berturut-turut dilakukan pemberian pereaksi geser atau diagnosis yaitu NaOH, AlCl
3
dan HCl, natrium asetat anhidrat dan H
3
BO
3
.
33 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Cara pembuatan pereaksi geser : a. NaOH 2 M
Larutan NaOH 2 M dibuat dengan melarutkan 80,00 gram NaOH dalam air bebas CO
2
hingga 1000 ml. b. AlCl
3
Larutan AlCl
3
dibuat dengan melarutkan 5 gram AlCl
3
dalam metanol hingga 100 ml.
c. HCl Larutan HCl dibuat dengan menambahkan 50 ml HCl pekat ke dalam 100
ml aquadest. d. NaOAc
Digunakan serbuk NaOAc anhidrat. e. H
3
BO
3
Digunakan serbuk asam borat anhidrat. Tahap-tahap pengerjaan dengan spektrofotometri UV adalah sebagai berikut :
a. Tahap I
Larutan isolat flavonoida dalam metanol dimasukkan dalam kuvet sampel. Pada kuvet blanko dimasukkan metanol. Keduanya dibaca serapannya pada
panjang gelombang 200-500 nm. b.
Tahap II Larutan sampel dari tahap I ditambah 3 tetes pereaksi NaOH, dicampur dan
dibaca serapannya pada panjang gelombang 200-500 nm. Setelah 5 menit
34 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
pembacaan serapan dilakukan kembali untuk mengetahui kemungkinan terjadinya dekomposisi flavonoida.
c. Tahap III
Larutan isolat flavonoida baru ditambah 6 tetes pereaksi AlCl
3
, dicampur dan dibaca serapannya pada panjang gelombang 200-500 nm.
d. Tahap IV Larutan sampel dari tahap III ditambah 3 tetes pereaksi HCl, dicampur dan
dibaca serapannya pada panjang gelombang 200-500 nm. e.
Tahap V Larutan isolat flavonoida baru dalam kuvet sampel ditambah serbuk NaOAc
anhidrat sampai kira-kira setinggi 2 mm dari dasar kuvet, dikocok dan dibaca serapannya pada panjang gelombang 200-500 nm.
f. Tahap VI
Larutan sampel dari tahap V ditambah serbuk H
3
BO
3
dengan jumlah setengah dari jumlah NaOAc yang digunakan, dicampur dan dibaca
serapannya pada panjang gelombang 200-500 nm.
E. Analisis Data
Metode yang dipakai dalam penelitian ini adalah metode non eksperimental deskriptif komparatif dengan data hasil penelitian yang berupa
harga Rf, warna bercak pada kromatogram, pembentukan warna pada reaksi warna, dan spektra hasil spektrofotometri UV senyawa flavonoida dengan
pergeseran panjang gelombang yang terjadi pada penambahan pereaksi geser.
35 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Data tersebut dianalisis dan dibandingkan dengan pustaka acuan menurut Venkataraman 1962 dan Markham 1988.
36 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tumbuhan
Determinasi tumbuhan dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman yang diteliti sesuai dengan yang dimaksud sehingga tidak terjadi kesalahan pada
jenis tanaman yang digunakan. Berdasar hasil determinasi lampiran 1, tumbuhan pegagan embun yang digunakan dalam penelitian ini memiliki nama ilmiah
Hydrocotyle sibthorpioides Lmk. Bagian tumbuhan yang digunakan untuk determinasi yaitu batang, daun, bunga dan buah.
B. Pengumpulan dan Pengeringan Bahan
Bahan berupa herba pegagan embun diperoleh dari lingkungan kampus Universitas Sanata Dharma, Paingan yang dikumpulkan pada bulan Januari tahun
2006. Herba sebelum dikeringkan terlebih dahulu dicuci dengan air mengalir. Pencucian herba dimaksudkan untuk menghilangkan kotoran-kotoran atau bahan-
bahan asing lain seperti tanah, kerikil, rumput, dan juga dengan pembersihan awal ini diharapkan dapat mengurangi jumlah mikroba.
Untuk membuat simplisia agar tidak mudah rusak dan tahan lama, maka herba pegagan embun dikeringkan dengan diangin-anginkan. Pemilihan cara
pengeringan ini karena simplisia yang digunakan berupa herba yang bersifat lunak dan tipis. Tujuan dari pengeringan ini adalah mengurangi kadar air agar
menghentikan reaksi enzimatik yang dapat menguraikan senyawa aktif dari simplisia tersebut dan juga dengan tidak adanya air dapat mencegah pertumbuhan
37 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kategori