gerak fase
rambat cm
jarak bercak
pusat titik
cm jarak
Rf =
Stahl, 1985. Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi
lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf antara lain struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan, sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya,
tebal dan kerataan dari lapisan penyerap, pelarut dan derajat kemurniannya fase gerak, derajat kejenuhan dari uap dalam bejana pengembangan yang digunakan,
teknik percobaan, jumlah cuplikan yang digunakan, suhu dan kesetimbangan Sastrohamidjojo, 2001.
F. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif KLTP
Kromatografi lapis tipis preparatif merupakan salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan
paling dasar Hostettmann et al., 1995. Ukuran pelat kromatografi biasanya 20 x 20 cm. Ketebalan lapisan dan ukuran pelat mempengaruhi jumlah bahan yang
akan dipisahkan dengan KLTP Stahl, 1969. Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada pelat
KLTP. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10 . Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin karena pemisahan bergantung pada lebar pita.
Penotolan dapat dilakukan dengan tangan pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis Stahl, 1967.
Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari pelat dengan spatula atau pengerok berbentuk tabung. Senyawa harus diekstraksi dari penjerap dengan
18 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
pelarut yang paling kurang polar yang mungkin sekitar 5 ml pelarut untuk 1 g penjerap Hostettmann et al., 1995.
KLT preparatif adalah cara yang ideal untuk pemisahan cuplikan kecil 50 mg sampai 1 g dari senyawa yang kurang atsiri Gritter, Bobbitt, Schwarting,
1991. Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah miligram Hostettmann et al., 1995.
KLTP berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis,
untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit, dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk mengalibrasi KLT
kuantitatif Gritter et al., 1991. Beberapa keuntungan KLTP dari kromatografi kolom adalah pemisahan yang lebih baik karena pemisahan yang dihasilkan
berupa bercak yang tidak bergerak, mudah mengambil senyawa-senyawa yang terpisah secara individu dengan jalan mengeroknya dan mengumpulkan tiap-tiap
lapisan, dan peralatannya yang sederhana Gasparic et al., 1978.
G. Spektrofotometri Ultraviolet
1. Tinjauan umum
Spektrofotometri ultraviolet adalah interaksi molekul yang mempunyai gugus kromofor dengan radiasi elektromagnetik pada daerah ultraviolet yang
menyebabkan transisi elektromagnetik dan diperoleh spektra absorbsi elektron, karena transisi elektronik yang terjadi tergantung dari strukturnya dan jumlah
radiasi elektromagnetik yang diabsorbsi ada hubungan dengan jumlah molekul
19 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
pengabsorbsi, maka spektra absorbsi dapat digunakan untuk analisa kualitatif yaitu memberikan informasi mengenai pola oksigenasi atau penentuan
kedudukan hidroksi fenol Sastrohamidjojo, 2001. Spektrum ultraviolet adalah suatu gambar antara panjang gelombang
atau frekuensi serapan lawan intensitas serapan Absorbansi. Absorbans suatu senyawa pada suatu panjang gelombang tertentu bertambah dengan banyaknya
molekul yang mengalami transisi. Oleh karena itu absorban bergantung pada struktur elektronik senyawanya dan juga pada kepekatan senyawa tersebut
Fessenden Fessenden, 1999. Transisi elektronik ditentukan oleh konfigurasi elektron dari orbital
molekul dan transisi vibrasi-rotasi ditentukan oleh gugusan-gugusan fungsional dari suatu molekul, jadi transisi ini ditentukan oleh struktur molekul sehingga
terdapat hubungan antara struktur molekul dengan frekuensi atau panjang gelombang. Hubungan ini merupakan dasar dari analisa kualitatif
Sastrohamidjojo, 1985. Terdapat pertalian antara panjang gelombang, frekuensi, dan kecepatan
cahaya yang dinyatakan oleh persamaan :
n c
=
ν λ
dimana c = kecepatan cahaya dalam hampa 2,9976 x 10
10
cmdet dan n adalah indeks bias perbandingan kecepatan cahaya dalam hampa dengan
kecepatannya dalam media Sastrohamidjojo, 2001. Untuk melukiskan bagaimana radiasi elektromagnetik berinteraksi
dengan benda, adalah perlu memikirkan berkas sinar sebagai foton. Tenaga
20 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
setiap foton berbanding langsung dengan frekuensi radiasi dan hal ini dinyatakan dalam persamaan :
λ ν
n c
h h
E =
=
dimana E = tenaga foton dalam erg, ν = frekuensi radiasi elektromagnetik
dalam hertz, dan h = tetapan Planck, 6,624 x 10
-34
J-det. Foton yang memiliki frekuensi yang tinggi panjang gelombang pendek mempunyai tenaga yang
lebih tinggi daripada foton yang berfrekuensi rendah panjang gelombang panjang Sastrohamidjojo, 2001.
Kromofor merupakan gugus molekul suatu zat yang dapat menyerap sinar tampak dan UV. Molekul yang mengandung kromofor dinamakan
kromogen. Auksokrom merupakan gugus yang bila berdiri sendiri tidak dapat menyerap sinar tampak dan UV, tetapi jika terikat pada sebuah kromofor akan
merubah panjang gelombang dan intensitas resapan maksimum. Contoh auksokrom adalah gugus hidroksil, gugus amino, dan halogen. Serah terima
antara elektron n dan elektron π pada kromofor membentuk n- π konjugasi.
Perubahan spektrum dapat diklasifikasikan sebagai berikut: a.
Pergeseran batokromik Pergeseran resapan ke arah panjang gelombang lebih panjang red shift.
b. Pergeseran hipsokromik
Pergeseran resapan ke arah panjang gelombang lebih pendek blue shift. c.
Efek hiperkromik Bertambahnya intensitas resapan gugus kromofor.
21 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
d. Efek hipokromik
Berkurangnya intensitas resapan gugus kromofor. Intensitas resapan dinyatakan dalam absorbtivitas molar pada panjang
gelombang maksimum, semakin besar nilai absorbtivitas molar makin besar intensitasnya Christian, 2004.
2. Spektrum senyawa flavonoida
Flavonoida mempunyai sistem aromatik terkonjugasi, karena itu mempunyai pita serapan di daerah ultravioletcahaya tampak. Spektra dari
golongan flavonoida dalam metanol memperlihatkan dua puncak utama yaitu pita I dan pita II pada daerah 240 nm-400 nm Tabel III. Pita I menunjukkan
absorbsi yang sesuai dengan cincin B sinamoil, sedangkan pita II berhubungan dengan absorbsi cincin A benzoil Gambar 4.
Tabel III. Rentangan serapan spektrum UV pada flavonoida Markham, 1988 Pita II nm
Pita I nm Jenis Flavonoida
250-280 310-350 Flavon
250-280 330-360
Flavonol 3-OH tersubstitusi 250-280
350-385 Flavonol 3-OH bebas
245-275 310-330 Isoflavon
320-329 Isoflavon 5-deoksi-6,7 dioksigenasi
275-295 300-330
Flavanon dan dihidroflavonol 230-270
kekuatan lemah 340-390 Khalkon
230-270 kekuatan kuat
380-430 Auron 270-280 465-560
Antosianin, antosianidin
22 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
O
O
2
3 4
10 9
8 7
6 5
A C
1 B
3 4
5 6
2 1
Gambar 4. Dua komponen penyerap benzoil dan sinamoil Untoro, 1990
Ket : 1 = komponen penyerap benzoil sebelum garis lurus 2 = komponen penyerap sinamoil setelah garis putus-putus
Senyawa fenolik dapat menunjukkan ciri karakteristik yaitu efek pergeseran batokromik dengan adanya basa natrium hidroksida yang
merupakan basa kuat sehingga dapat mengionisasi sejumlah gugus hidroksi pada inti flavonoida Tabel IV.
Natrium asetat NaOAc merupakan basa lemah dan mengionisasi gugus yang mempunyai sifat keasaman tinggi yang dalam molekul flavonoida
dapat ditemukan pada posisi 7. Ada beberapa perkecualian, penambahan NaOAc akan menunjukkan pergeseran batokromik sebesar 5-20 nm pada pita II
untuk flavon dan flavonol yang mempunyai gugus 7-OH bebas Tabel V. Penambahan NaOAc dan H
3
BO
3
akan membentuk kompleks dengan gugus orto dihidroksi pada semua posisi kecuali pada atom C
5
dan C
6
Tabel VI.
Adanya AlCl
3
dan AlCl
3
HCl, dapat membentuk kompleks tahan asam antara gugus hidroksil dan keton yang bertentangan dan membentuk kompleks
23 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
tak tahan asam dengan gugus orto-dihidroksi, pereaksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi kedua gugus tersebut. Jadi spektrum AlCl
3
merupakan penjumlahan pengaruh semua kompleks terhadap spektrum, sedangkan
spektrum AlCl
3
dan HCl hanya merupakan pengaruh kompleks hidroksi-keto Tabel VII.
24 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel IV. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOH Markham, 1988
Pergeseran tampak Jenis
Flavonoida Pita I
Pita II Petunjuk
penafsiran Kekuatannya
menurun terus 3’,4’OH,
o-diOH pada cincin A dan
pada cincin B: 3OH yang
berdampingan
Mantap ±45-65 nm kekuatan tidak
menurun 4’-OH
Mantap ±45-65 nm kekuatan menurun
3-OH, tidak ada 4’-OH bebas
Flavon Flavonol
Pita baru bandingkan dengan MeOH 7-OH
Tidak ada
pergeseran Tidak ada OH
pada cincin A Kekuatan
menurun o-di OH pada
cincin A penurunan
lambat; O-diOH pada cincin B
Isoflavon, flavanon, dan
dihidroflavon ol
Bergeser dari
±280 nm ke ±325 nm, kekuatan
meningkat ke 330-340 nm
Flavanon dan dihidroflavonol
dengan 5,7-OH, 7- OH tanpa 5-OH
bebas
Auron Khalkon
+ 80-95 nm kekuatan
meningkat +60-70 kekuatan
naik pergeseran kecil
4’OH auron 6- OH tanpa
oksigenasi pada 4’ auron
6-OH dengan oksigenasi pada 4’
auron
+60-100nm kekuatan naik
tanpa kenaikan kekuatan
+40-50 nm 4’OH
auron 2-OH atau 4’OH
dan tanpa 4’OH 4’OH 2’OH atau
4’OH
Antosianidin Antosian
Semuanya terurai kecuali 3-
deoksiantosianin Nihil
25 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel V. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc Markham, 1988
Pergeseran yang tampak Jenis
flavonoida Pita I
Pita II Petunjuk Flavonoida
+5-20 nm
berkurang bila ada oksigenasi
pada 68 7-OH
Flavon Flavonol
Isoflavon
Kekuatannya berkurang dengan bertambahnya waktu
-OH di 6,7 atau 7,8 atau 3,4’
+35 nm
+60 nm 7-OH dengan 5-OH
7-OH tanpa 5-OH Flavanon
Dihidroflavonol Kekuatannya berkurang dengan
bertambahnya waktu -OH di 6,7 atau 7,8
Pergeseran batokromik atau bahu pada panjang gelombang yang
lebih panjang 4’-OH dan atau 4-
OH khalkon 4’-OH dan atau tanpa 6-OH
Auron
Tabel VI. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc dan H
3
BO
3
Markham, 1988 Pergeseran Tampak
Jenis flavonoida
Pita I Pita II
Petunjuk penafsiran
Flavonol, Auron,
Khalkon +12-36 nm nisbi
terhadap spektrum metanol,
pergeseran lebih kecil
o-di OH pada cincin B
o-di OH pada cincin A 6,7
atau 7,8
Isoflavon, Flavanon,
Dihidroflavonol +10-15 nm nisbi
terhadap spektrum metanol
o-di OH pada cincin A 6,7
atau 7,8
26 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel VII. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan AlCl
3
serta AlCl
3
dan HCl Markham, 1988
Pergeseran yang tampak Jenis flavonoida
Pereaksi Pita I
Pita II Petunjuk penafsiran
+35 sampai 55 nm +17 sampai 20 nm
Tak berubah 5- OH
5-OH dengan oksigenasi pada 6
Mungkin 5-OH dengan gugus prenil pada 6
+ 50 sampai 60 nm Mungkin
3-OH dengan atau tanpa 5-
OH Pergeseran
AlCl
3
HCl tambah 30 sampai 40 nm
o-diOH pada cincin B Flavanon dan
flavonon AlCl
3
dan HCl AlCl
3
Pergeseran AlCl
3
HCl tambah 20 sampai 25 nm
o-di OH pada cincin A Tambahan pada
pergeseran o-di OH pada cincin B
+10 sampai 14 nm
+20 sampai 26 nm
5-OH Isoflavon 5-OH Flavanon,
dihidroflavonol
Pergeseran AlCl
3
HCl, tambah 11
sampai 30 nm o-diOH pada cincin A
6,7 dan 7,8 Isoflavon,
flavanon, dan dihidroflavonol
AlCl
3
dan HCl AlCl
3
Pergeseran AlCl
3
HCl tambah 30
sampai 38 nm Dihidroflavonol tanpa
5-OH tambahan pada sembarang pergeseran
o-di OH
+48 sampai 64 nm +40 nm
+60 sampai 70 nm 2’-OH Khalkon
2’-OH Khalkon dengan oksigenasi
pada 3’ 4-OH Auron
Pergeseran AlCl
3
HCl tambah 40 sampai 70 nm
o-diOH pada cincin B Auron, Khalkon
AlCl
3
dan HCl AlCl
3
Penambahan lebih kecil
Mungkin o-diOH pada cincin A
+25 sampai 35 nm Pada pH 2-4
o-diOH Antosianidin,
Antosianin AlCl
3
Pergeseran lebih besar
Banyak o-diOH atau o- diOH 3-deoksi
antosianidin
27 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
H. Keterangan Empiris
Penelitian ini bersifat eksploratif dengan tujuan untuk mengidentifikasi struktur parsial senyawa flavonoida dalam herba pegagan embun selain hiperin
hasil isolasi secara KLTP yang dapat ditentukan dari warna bercak dan harga Rf pada KLT, hasil reaksi warna dan spektrofotometri UV berdasarkan pembentukan
pita serapan yang karakteristik dengan penambahan pereaksi geser.
28 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian non eksperimental yang dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata
Dharma, Yogyakarta.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian
a. Variabel terkendali : sumber tumbuhan, pengumpulan tumbuhan, pengeringan, pembuatan serbuk, proses penyarian flavonoida dan bahan-
bahan pereaksi yang digunakan. b. Variabel tak terkendali : kondisi fisiologis tumbuhan dan kondisi tempat
tumbuh.
2. Definisi operasional
a. Isolasi flavonoida herba pegagan embun adalah proses pengambilan senyawa
flavonoida dari herba pegagan embun dengan maserasi dan dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis preparatif KLTP.
b. Identifikasi senyawa flavonoida adalah uji kualitatif untuk mengetahui
prakiraan struktur parsial senyawa flavonoida dalam herba pegagan embun secara kromatografi lapis tipis KLT, reaksi warna dan spektrofotometri
ultraviolet.
29 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI