Kromatografi Lapis Tipis Preparatif KLTP Keterangan Empiris

gerak fase rambat cm jarak bercak pusat titik cm jarak Rf = Stahl, 1985. Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf antara lain struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan, sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya, tebal dan kerataan dari lapisan penyerap, pelarut dan derajat kemurniannya fase gerak, derajat kejenuhan dari uap dalam bejana pengembangan yang digunakan, teknik percobaan, jumlah cuplikan yang digunakan, suhu dan kesetimbangan Sastrohamidjojo, 2001.

F. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif KLTP

Kromatografi lapis tipis preparatif merupakan salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan paling dasar Hostettmann et al., 1995. Ukuran pelat kromatografi biasanya 20 x 20 cm. Ketebalan lapisan dan ukuran pelat mempengaruhi jumlah bahan yang akan dipisahkan dengan KLTP Stahl, 1969. Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada pelat KLTP. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10 . Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin karena pemisahan bergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan tangan pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis Stahl, 1967. Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari pelat dengan spatula atau pengerok berbentuk tabung. Senyawa harus diekstraksi dari penjerap dengan 18 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI pelarut yang paling kurang polar yang mungkin sekitar 5 ml pelarut untuk 1 g penjerap Hostettmann et al., 1995. KLT preparatif adalah cara yang ideal untuk pemisahan cuplikan kecil 50 mg sampai 1 g dari senyawa yang kurang atsiri Gritter, Bobbitt, Schwarting, 1991. Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah miligram Hostettmann et al., 1995. KLTP berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit, dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk mengalibrasi KLT kuantitatif Gritter et al., 1991. Beberapa keuntungan KLTP dari kromatografi kolom adalah pemisahan yang lebih baik karena pemisahan yang dihasilkan berupa bercak yang tidak bergerak, mudah mengambil senyawa-senyawa yang terpisah secara individu dengan jalan mengeroknya dan mengumpulkan tiap-tiap lapisan, dan peralatannya yang sederhana Gasparic et al., 1978.

G. Spektrofotometri Ultraviolet

1. Tinjauan umum

Spektrofotometri ultraviolet adalah interaksi molekul yang mempunyai gugus kromofor dengan radiasi elektromagnetik pada daerah ultraviolet yang menyebabkan transisi elektromagnetik dan diperoleh spektra absorbsi elektron, karena transisi elektronik yang terjadi tergantung dari strukturnya dan jumlah radiasi elektromagnetik yang diabsorbsi ada hubungan dengan jumlah molekul 19 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI pengabsorbsi, maka spektra absorbsi dapat digunakan untuk analisa kualitatif yaitu memberikan informasi mengenai pola oksigenasi atau penentuan kedudukan hidroksi fenol Sastrohamidjojo, 2001. Spektrum ultraviolet adalah suatu gambar antara panjang gelombang atau frekuensi serapan lawan intensitas serapan Absorbansi. Absorbans suatu senyawa pada suatu panjang gelombang tertentu bertambah dengan banyaknya molekul yang mengalami transisi. Oleh karena itu absorban bergantung pada struktur elektronik senyawanya dan juga pada kepekatan senyawa tersebut Fessenden Fessenden, 1999. Transisi elektronik ditentukan oleh konfigurasi elektron dari orbital molekul dan transisi vibrasi-rotasi ditentukan oleh gugusan-gugusan fungsional dari suatu molekul, jadi transisi ini ditentukan oleh struktur molekul sehingga terdapat hubungan antara struktur molekul dengan frekuensi atau panjang gelombang. Hubungan ini merupakan dasar dari analisa kualitatif Sastrohamidjojo, 1985. Terdapat pertalian antara panjang gelombang, frekuensi, dan kecepatan cahaya yang dinyatakan oleh persamaan : n c = ν λ dimana c = kecepatan cahaya dalam hampa 2,9976 x 10 10 cmdet dan n adalah indeks bias perbandingan kecepatan cahaya dalam hampa dengan kecepatannya dalam media Sastrohamidjojo, 2001. Untuk melukiskan bagaimana radiasi elektromagnetik berinteraksi dengan benda, adalah perlu memikirkan berkas sinar sebagai foton. Tenaga 20 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI setiap foton berbanding langsung dengan frekuensi radiasi dan hal ini dinyatakan dalam persamaan : λ ν n c h h E = = dimana E = tenaga foton dalam erg, ν = frekuensi radiasi elektromagnetik dalam hertz, dan h = tetapan Planck, 6,624 x 10 -34 J-det. Foton yang memiliki frekuensi yang tinggi panjang gelombang pendek mempunyai tenaga yang lebih tinggi daripada foton yang berfrekuensi rendah panjang gelombang panjang Sastrohamidjojo, 2001. Kromofor merupakan gugus molekul suatu zat yang dapat menyerap sinar tampak dan UV. Molekul yang mengandung kromofor dinamakan kromogen. Auksokrom merupakan gugus yang bila berdiri sendiri tidak dapat menyerap sinar tampak dan UV, tetapi jika terikat pada sebuah kromofor akan merubah panjang gelombang dan intensitas resapan maksimum. Contoh auksokrom adalah gugus hidroksil, gugus amino, dan halogen. Serah terima antara elektron n dan elektron π pada kromofor membentuk n- π konjugasi. Perubahan spektrum dapat diklasifikasikan sebagai berikut: a. Pergeseran batokromik Pergeseran resapan ke arah panjang gelombang lebih panjang red shift. b. Pergeseran hipsokromik Pergeseran resapan ke arah panjang gelombang lebih pendek blue shift. c. Efek hiperkromik Bertambahnya intensitas resapan gugus kromofor. 21 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI d. Efek hipokromik Berkurangnya intensitas resapan gugus kromofor. Intensitas resapan dinyatakan dalam absorbtivitas molar pada panjang gelombang maksimum, semakin besar nilai absorbtivitas molar makin besar intensitasnya Christian, 2004.

2. Spektrum senyawa flavonoida

Flavonoida mempunyai sistem aromatik terkonjugasi, karena itu mempunyai pita serapan di daerah ultravioletcahaya tampak. Spektra dari golongan flavonoida dalam metanol memperlihatkan dua puncak utama yaitu pita I dan pita II pada daerah 240 nm-400 nm Tabel III. Pita I menunjukkan absorbsi yang sesuai dengan cincin B sinamoil, sedangkan pita II berhubungan dengan absorbsi cincin A benzoil Gambar 4. Tabel III. Rentangan serapan spektrum UV pada flavonoida Markham, 1988 Pita II nm Pita I nm Jenis Flavonoida 250-280 310-350 Flavon 250-280 330-360 Flavonol 3-OH tersubstitusi 250-280 350-385 Flavonol 3-OH bebas 245-275 310-330 Isoflavon 320-329 Isoflavon 5-deoksi-6,7 dioksigenasi 275-295 300-330 Flavanon dan dihidroflavonol 230-270 kekuatan lemah 340-390 Khalkon 230-270 kekuatan kuat 380-430 Auron 270-280 465-560 Antosianin, antosianidin 22 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI O O 2 3 4 10 9 8 7 6 5 A C 1 B 3 4 5 6 2 1 Gambar 4. Dua komponen penyerap benzoil dan sinamoil Untoro, 1990 Ket : 1 = komponen penyerap benzoil sebelum garis lurus 2 = komponen penyerap sinamoil setelah garis putus-putus Senyawa fenolik dapat menunjukkan ciri karakteristik yaitu efek pergeseran batokromik dengan adanya basa natrium hidroksida yang merupakan basa kuat sehingga dapat mengionisasi sejumlah gugus hidroksi pada inti flavonoida Tabel IV. Natrium asetat NaOAc merupakan basa lemah dan mengionisasi gugus yang mempunyai sifat keasaman tinggi yang dalam molekul flavonoida dapat ditemukan pada posisi 7. Ada beberapa perkecualian, penambahan NaOAc akan menunjukkan pergeseran batokromik sebesar 5-20 nm pada pita II untuk flavon dan flavonol yang mempunyai gugus 7-OH bebas Tabel V. Penambahan NaOAc dan H 3 BO 3 akan membentuk kompleks dengan gugus orto dihidroksi pada semua posisi kecuali pada atom C 5 dan C 6 Tabel VI. Adanya AlCl 3 dan AlCl 3 HCl, dapat membentuk kompleks tahan asam antara gugus hidroksil dan keton yang bertentangan dan membentuk kompleks 23 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI tak tahan asam dengan gugus orto-dihidroksi, pereaksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi kedua gugus tersebut. Jadi spektrum AlCl 3 merupakan penjumlahan pengaruh semua kompleks terhadap spektrum, sedangkan spektrum AlCl 3 dan HCl hanya merupakan pengaruh kompleks hidroksi-keto Tabel VII. 24 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel IV. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOH Markham, 1988 Pergeseran tampak Jenis Flavonoida Pita I Pita II Petunjuk penafsiran Kekuatannya menurun terus 3’,4’OH, o-diOH pada cincin A dan pada cincin B: 3OH yang berdampingan Mantap ±45-65 nm kekuatan tidak menurun 4’-OH Mantap ±45-65 nm kekuatan menurun 3-OH, tidak ada 4’-OH bebas Flavon Flavonol Pita baru bandingkan dengan MeOH 7-OH Tidak ada pergeseran Tidak ada OH pada cincin A Kekuatan menurun o-di OH pada cincin A penurunan lambat; O-diOH pada cincin B Isoflavon, flavanon, dan dihidroflavon ol Bergeser dari ±280 nm ke ±325 nm, kekuatan meningkat ke 330-340 nm Flavanon dan dihidroflavonol dengan 5,7-OH, 7- OH tanpa 5-OH bebas Auron Khalkon + 80-95 nm kekuatan meningkat +60-70 kekuatan naik pergeseran kecil 4’OH auron 6- OH tanpa oksigenasi pada 4’ auron 6-OH dengan oksigenasi pada 4’ auron +60-100nm kekuatan naik tanpa kenaikan kekuatan +40-50 nm 4’OH auron 2-OH atau 4’OH dan tanpa 4’OH 4’OH 2’OH atau 4’OH Antosianidin Antosian Semuanya terurai kecuali 3- deoksiantosianin Nihil 25 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel V. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc Markham, 1988 Pergeseran yang tampak Jenis flavonoida Pita I Pita II Petunjuk Flavonoida +5-20 nm berkurang bila ada oksigenasi pada 68 7-OH Flavon Flavonol Isoflavon Kekuatannya berkurang dengan bertambahnya waktu -OH di 6,7 atau 7,8 atau 3,4’ +35 nm +60 nm 7-OH dengan 5-OH 7-OH tanpa 5-OH Flavanon Dihidroflavonol Kekuatannya berkurang dengan bertambahnya waktu -OH di 6,7 atau 7,8 Pergeseran batokromik atau bahu pada panjang gelombang yang lebih panjang 4’-OH dan atau 4- OH khalkon 4’-OH dan atau tanpa 6-OH Auron Tabel VI. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc dan H 3 BO 3 Markham, 1988 Pergeseran Tampak Jenis flavonoida Pita I Pita II Petunjuk penafsiran Flavonol, Auron, Khalkon +12-36 nm nisbi terhadap spektrum metanol, pergeseran lebih kecil o-di OH pada cincin B o-di OH pada cincin A 6,7 atau 7,8 Isoflavon, Flavanon, Dihidroflavonol +10-15 nm nisbi terhadap spektrum metanol o-di OH pada cincin A 6,7 atau 7,8 26 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel VII. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan AlCl 3 serta AlCl 3 dan HCl Markham, 1988 Pergeseran yang tampak Jenis flavonoida Pereaksi Pita I Pita II Petunjuk penafsiran +35 sampai 55 nm +17 sampai 20 nm Tak berubah 5- OH 5-OH dengan oksigenasi pada 6 Mungkin 5-OH dengan gugus prenil pada 6 + 50 sampai 60 nm Mungkin 3-OH dengan atau tanpa 5- OH Pergeseran AlCl 3 HCl tambah 30 sampai 40 nm o-diOH pada cincin B Flavanon dan flavonon AlCl 3 dan HCl AlCl 3 Pergeseran AlCl 3 HCl tambah 20 sampai 25 nm o-di OH pada cincin A Tambahan pada pergeseran o-di OH pada cincin B +10 sampai 14 nm +20 sampai 26 nm 5-OH Isoflavon 5-OH Flavanon, dihidroflavonol Pergeseran AlCl 3 HCl, tambah 11 sampai 30 nm o-diOH pada cincin A 6,7 dan 7,8 Isoflavon, flavanon, dan dihidroflavonol AlCl 3 dan HCl AlCl 3 Pergeseran AlCl 3 HCl tambah 30 sampai 38 nm Dihidroflavonol tanpa 5-OH tambahan pada sembarang pergeseran o-di OH +48 sampai 64 nm +40 nm +60 sampai 70 nm 2’-OH Khalkon 2’-OH Khalkon dengan oksigenasi pada 3’ 4-OH Auron Pergeseran AlCl 3 HCl tambah 40 sampai 70 nm o-diOH pada cincin B Auron, Khalkon AlCl 3 dan HCl AlCl 3 Penambahan lebih kecil Mungkin o-diOH pada cincin A +25 sampai 35 nm Pada pH 2-4 o-diOH Antosianidin, Antosianin AlCl 3 Pergeseran lebih besar Banyak o-diOH atau o- diOH 3-deoksi antosianidin 27 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

H. Keterangan Empiris

Penelitian ini bersifat eksploratif dengan tujuan untuk mengidentifikasi struktur parsial senyawa flavonoida dalam herba pegagan embun selain hiperin hasil isolasi secara KLTP yang dapat ditentukan dari warna bercak dan harga Rf pada KLT, hasil reaksi warna dan spektrofotometri UV berdasarkan pembentukan pita serapan yang karakteristik dengan penambahan pereaksi geser. 28 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian non eksperimental yang dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian

a. Variabel terkendali : sumber tumbuhan, pengumpulan tumbuhan, pengeringan, pembuatan serbuk, proses penyarian flavonoida dan bahan- bahan pereaksi yang digunakan. b. Variabel tak terkendali : kondisi fisiologis tumbuhan dan kondisi tempat tumbuh.

2. Definisi operasional

a. Isolasi flavonoida herba pegagan embun adalah proses pengambilan senyawa flavonoida dari herba pegagan embun dengan maserasi dan dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis preparatif KLTP. b. Identifikasi senyawa flavonoida adalah uji kualitatif untuk mengetahui prakiraan struktur parsial senyawa flavonoida dalam herba pegagan embun secara kromatografi lapis tipis KLT, reaksi warna dan spektrofotometri ultraviolet. 29 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI