3. Pembuatan ekstrak etanolik daun salam
Maserasi dilakukan pada 50 g serbuk daun salam 500 mL pelarut etanol 96 dengan kecepatan 120 rpm selama 5 hari. Disaring dengan kertas saring
dengan bantuan pompa vacuum lalu dipekatkan menggunakan rotary vacuum evaporator sampai terbentuk cairan kental. Dilanjutkan dengan menggunakan
penangas air selama 15-20 menit dengan suhu antara 50 -60
C sampai diperoleh ekstrak kental.
4. Skrining fitokimia serbuk daun salam
a. Uji flavonoid. Sebanyak 1 g serbuk daun salam ditambahkan
dengan 5 mL aquadest, lalu dipanaskan selama 10 menit. Selanjutnya disaring, filtrat ditambahkan dengan NaOH LP kemudian ditambahkan dengan HCl.
Adanya perubahan warna merah menjadi kurang pekat menunjukkan adanya flavonoid.
b. Uji tanin. Sebanyak 2 g serbuk daun salam ditambahkan dengan 10
mL aquadest, lalu dipanaskan selama 30 menit dalam penangas air hingga mendidih. Selanjutnya disaring, filtrat sebanyak 5 mL ditambahkan larutan
natrium klorida 2 sebanyak 1 mL. Apabila terbentuk suspensi atau endapan disaring dengan kertas saring kemudian filtrat ditambahkan larutan gelatin 1
sebanyak 5 mL. Terbentuknya endapan menunjukkan adanya tanin. Selain itu dapat juga dengan menambahkan 5 tetes FeCl
3
pada filtrat. Dikatakan positif tanin jika terjadi perubahan warna menjadi biru kehitaman.
5. Analisis flavonoid dan tanin serbuk daun salam dengan KLT
a. Flavonoid. Sebanyak 1 g daun salam ditimbang dan ditambahkan
dalam 10 mL metanol, selanjutnya dipanaskan selama 5 menit pada suhu 60 C.
Filtrat jernih ditotolkan pada lempeng KLT sebanyak 25-30 µL. Dibuat standar rutin dengan konsentrasi 0,05 dilarutkan dengan metanol. Fase diam yang
digunakan adalah selulosa dengan fase gerak n-butanol:asam asetat glasial:air 40:10:50. Deteksi bercak hasil elusi diamati pada sinar UV dengan panjang
gelombang 254 dan 365 nm. Bercak yang muncul ditandai untuk dihitung nilai Rfnya. Plat KLT kemudian dimasukkan dalam chamber yang telah dijenuhkan
dengan amoniak. Hasil positif ditunjukkan dengan penampakan bercak yang berwarna merah kekuningan.
b. Tanin. Sebanyak 1 g daun salam ditimbang dan ditambahkan
dalam 10 mL metanol, selanjutnya dipanaskan selama 5 menit pada suhu 60 C.
Filtrat jernih ditotolkan pada lempeng KLT sebanyak 25-30 µL. Standar tanin dibuat dengan membuat larutan asam tanat 0,05 dalam etanol. Fase diam yang
digunakan adalah silika gel GF
254
dengan fase gerak kloroform:metanol:air 14:6:0,8. Penampak noda yang digunakan adalah FeCl
3
. Apabila timbul warna biru kehitaman sampai hitam menunjukkan adanya senyawa tanin.
6. Uji daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam terhadap Streptococcus mutans
a. Pembuatan konsentrasi ekstrak etanolik daun salam. Dibuat dalam
beberapa konsentrasi 5, 10, 20, 30, dan 50 mgmL menggunakan pelarut aquadest steril dengan suhu pemanasan 40
-50 C.
b. Pembuatan stok bakteri Streptococcus mutans. Diambil 1-3 ose
bakteri dari biakan murni Streptococcus mutans, lalu diinokulasikan secara streak plate pada media MHA miring, diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37
C. Hasil inokulan digunakan sebagai stok untuk tahap penelitian selanjutnya.
c. Pembuatan suspensi bakteri Streptococcus mutans. Diambil 1-3 ose
dari stok bakteri Streptococcus mutans, lalu diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi NaCl 0,9 dan divortex agar tercampur rata, diinkubasikan
selama 24 jam pada suhu 37 C. Kekeruhan suspensi bakteri Streptococcus mutans
disetarakan dengan standar 0,5 Mc Farland II diperkirakan 1,5x10
8
sel bakterimL dengan menggunakan Densicheck.
d. Pembuatan kontrol kontaminasi media. Media MHA steril dituang
ke dalam cawan petri, dibiarkan memadat, diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37
C. Setelah diinkubasi, diamati, dan dibandingkan dengan perlakuan. e.
Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Streptococcus mutans. Media MHA steril dengan suhu 40
-50 C, diinokulasikan suspensi bakteri uji, lalu
dituang ke cawan petri steril dan digoyang sehingga pertumbuhan bakteri merata. Cawan petri lalu diinkubasi 24 jam dengan suhu 37
C. Diamati pertumbuhan bakteri uji melalui kekeruhan media yang dibandingkan dengan perlakuan.
f. Uji daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam terhadap
Streptococcus mutans dengan metode difusi sumuran. Diambil 1 mL dari suspensi bakteri uji yang sudah disetarakan dengan standar 0,5 Mc Farland II diperkirakan
1,5x10
8
sel bakterimL menggunakan Densicheck, diinokulasikan ke media MHA cair secara pour plate, kemudian dituang ke dalam cawan petri steril. Dibuat 7
lubang sumuran dengan diameter 6 mm pada cawan petri yang berisi media MHA yang telah padat selanjutnya diisi dengan 30 µL media MHA. Ditambahkan
dengan 50 µL ekstrak etanolik daun salam dengan konsentrasi 5, 10, 20, 30, dan 50 mgmL, aquadest steril sebagai kontrol negatif, dan klorheksidin 0,2
sebagai kontrol positif. Cawan petri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C,
kemudian diamati serta diukur diameter zona hambat yang dihasilkan dengan menggunakan jangka sorong.
g. Penentuan Kadar Hambat Minimum KHM dan Kadar Bunuh
Minimum KBM ekstrak etanolik daun salam terhadap Streptococcus mutans dengan metode dilusi padat. Diambil 1 ose bakteri uji, kemudian disuspensikan ke
dalam 10 mL NaCl 0,9, dicampur sampai rata. Hasil suspensi dibandingkan dengan standar 0,5 Mc Farland II diperkirakan 1,5x10
8
sel bakterimL menggunakan Densicheck, lalu diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam
media MHA cair. Ekstrak dengan konsentrasi 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 mgmL masing-masing ditambahkan sebanyak 1 mL ke dalam 30 mL MHA
dengan suhu 40 -50
C. Dituang ke dalam cawan petri secara pour plate. Cawan petri diinkubasikan selama 24 jam dalam suhu 37
C, dan dilakukan pengamatan. Pertumbuhan bakteri ditunjukkan dengan kekeruhan media. Semakin subur
pertumbuhan bakteri pada media, maka semakin keruh media tersebut. KHM dan KBM dapat diketahui dengan cara membandingkan kejernihan media yang
diinokulasikan larutan uji dengan kontrol negatif dan kontrol positif. Pada setiap media pertumbuhan yang jernih, dilakukan pengujian
berikutnya dengan melakukan pemindahan bakteri secara streak ke media MHA yang baru. KHM adalah konsentrasi terkecil dimana ekstrak mampu menghambat
pertumbuhan bakteri, ditunjukkan dengan media pertumbuhan yang jernih, namun masih menunjukkan adanya pertumbuhan pada hasil streak. KBM adalah
konsentrasi terkecil yang dapat membunuh bakteri, ditandai dengan tidak adanya
pertumbuhan pada hasil streak plate yang menandakan bakteri uji mati karena larutan uji dengan konsentrasi tersebut.
Uji ini menggunakan dua macam kontrol, yaitu kontrol negatif dan kontrol positif. Kontrol negatif dibuat dengan menambahkan sebanyak 1 mL
bakteri uji dan 1 mL aquadest ke dalam media MHA pada cawan petri steril secara pour plate. Kontrol positif dibuat dengan menambahkan sebanyak 1 mL
bakteri uji dan 1 mL klorheksidin pada media MHA secara pour plate pada cawan petri. Penentuan rentang konsentrasi uji yang digunakan dalam uji ini mengacu
pada hasil uji sebelumnya di mana pada konsentrasi terendah ekstrak etanolik daun salam masih menunjukkan adanya zona hambat yang terbentuk.
G. Analisis Data
Kategori