17
III METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Balai Penelitian Ternak Ciawi Bogor mulai Desember 2009 hingga Mei 2010.
3.2 Mikroba. 3.2.1
Bacillus amyloliquefaciens
Biakan Bacillus amyloliquefaciens diperoleh dari kultur pemurnian Wizna et al
. 2005, kemudian diperbanyak dengan metode Kompiang komunikasi pribadi. Dalam penelitian ini mengandung CFU 18,7x10
16
. 3.2.2
Trichoderma harzianum
Biakan siap pakai Trichoderma harzianum diperoleh dari Balitnak dengan CFU 3,3x10
2
Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut: satu koloni dihitung 1 koloni, dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni, beberapa
koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni, dua koloni yang berhimpitan dan masih bdapat dibedakan dihitung 2 koloni, koloni yang terlalu besar lebih besar
.
3.2.3 Penghitungan Jumlah Mikroorganisme
Penghitungan jumlah mikroorganisme dengan cara viable count atau disebut juga sebagai standard plate count SPC didasarkan pada asumsi bahwa
setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah diinkubasi dalam media biakan dan lingkungan yang sesuai. Setelah masa
inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Berdasarkan hal
tersebut digunakan istilah colony forming units CFU ml. Koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari
sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah mikrobanya.
18
dari setengah luas cawan tidak dihitung, koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.
Penghitungan jumlah mikroorganisme hidup viable count adalah jumlah minimum mikroorganisme. Hal ini disebabkan koloni yang tumbuh pada
lempengan agar merupakan gambaran mikroorganisme yang dapat tumbuh dan berbiak dalam media dan suhu inkubasi tertentu seperti pada gambar dibawah ini.
Gambar 7. Cara penghitungan jumlah mikroorganisme hidup
Teknik dilusi pengenceran
Teknik dilusi sangat penting di dalam analisa mikrobiologi. Karena hampir semua metode perhitungan jumlah sel mikroba mempergunakan teknik ini, seperti
TPC Total Plate Count. Bahan yang digunakan adalah, PCA Plate Count Agar
, BPW Buffer Pepton Water, aquades Steril NaCl fisiologis, alkohol 70 , NaCl. Peralatan yang dipakai terdiri dari: Petri Dish, autoclaf, tabung reaksi,
inkubator, erlenmeyer, pipet ukur, bunsen Burner, dan laminar air flow. Metodenya adalah sebagai berikut: Larutan kultur diambil 1 ml dan
dimasukkan ke dalam 9 ml NaCl fisiologis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh pengenceran110 bagian. Dari larutan pengenceran 110 diambil 1 ml
dan dimasukkan ke dalam 9 ml aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1100 bagian. Dari larutan pengenceran 1100 diambil 1 ml
dan dimasukkan ke dalam 9 ml NaCl fisiologis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 11000 bagian. Demikian seterusnya hingga pengenceran yang
diinginkan, kemudian ditanam pada media agar Potato Dextro Agar dan diinkubasi selama 36-48 jam seperti terlihat pada Gambar 8. Mikroba yang dapat
19
dihitung pada kisaran 30-300 koloni. Jumlah sel mikroba dapat diketahui dengan cara menghitung sel relatif CFU per ml:
CFU ml = jumlah koloni x faktor pengenceran dimana :
Jumlah koloni = jumlah koloni mikroba yang tumbuh pada media agar faktor pengenceran= larutan pengenceran misalnya 1100
Gambar 8. Alur pengenceran pada penghitungan mikroba Setelah inkubasi, dihitung semua koloni yang terbentuk yang berada pada
kisaran 30-300 koloni dan dicatat pada tiap dilusi yang berbeda. Hanya plate yang berjumlah 30-300 koloni yang countable dapat dihitung. Hal ini dikarenakan
jumlah koloni yang kurang dari 30 dianggap negatif karena akan memberikan nilai probabilitias 0, sehingga sampel tidak absah secara statistik untuk digunakan
20
dalam penghitungan. Jumlah koloni yang lebih dari 300 tidak dapat dihitung karena saling menumpuknya koloni sehingga perhitungan menjadi tidak akurat.
3.2.4 Perbanyakan B. amyloliquefaciens
Kategori