27
secara manual, sehingga perhitungan dilakukan dengan mengukur tinggi khromatogram standar dan tinggi khromatogram contoh dalam satuan cm.
Perhitungan: t spl
Asam amino = ------- x0,250 µmolml x BM AA x 3 ml x 10
-6
x df x 100 t std
-------------------------------------------------------------------------- bobot contoh x 10
-3
g Keterangan:
t spl = tinggi puncak khromatogram contoh
t std = tinggi puncak khromatogram standar
0,250 µmolml = konsentrasi standar 3 ml
= volume akhir contoh BM AA
= bobot molekul masing-masing asam amino df
= faktor pengenceran Total asam amino adalah total asam amino yang diperoleh dari hasil analisis
contoh.
3.12 Uji Aktivitas Enzim Selulase
Pengujian aktivitas enzim selulase dilakukan dengan metode DNS dinitrosalicylic acid Miller 1959. Bungkil inti sawit yang telah diinkubasi
dengan isolat dipindahkan ke tabung propylene. Selanjutnya ditambahkan 25ml buffer sitrat dengan pH 6,0, 50 mM, lalu diaduk dengan menggunakan vortex 15
menit dan disentrifus selama 15 pada 3500 rpm, suhu 4-5
o
C. Selanjutnya sebanyak 0,75 ml supernatan enzim dicampur 0,75 ml 1 CMCase enzim
selulase dalam buffer sitar dengan pH 6,0. Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit, kemudian ditambahkan 1,5 ml dinitrosalicylic acid.
Selanjutnya dipanaskan selama 15 menit dan didinginkan selama 20 menit dan dibaca dengan menggunakan spektrofotometer 575 nM. Perhitungan aktivitas
enzim selulase dapat dilakukan dengan rumus sebagai berikut, kadar glukosa x pengenceran
Aktivitas enzim = ------------------------------------------------
Berat molekul glukosa x waktu inkubasi
28
Keterangan: Satu unit aktivitas selulase adalah jumlah enzim yang melepaskan µmol glukosa
dalam satu menit pada kondisi pengujian. Faktor pengenceran = 1
Berat molekul glukosa 180 Waktu inkubasi 30 menit.
3.13 Uji Aktivitas Enzim Mananase
Uji aktivitas enzim mananase dilakukan berdasarkan metode Purwadaria et al.
1988. Aktivitas mananase dianalisis dengan menggunakan gum locust bean 0,5 dalam buffer asetat dengan pH 4,8 dan suhu optimum 40
o
C. Filtrat enzim, buffer dan substrat diinkubasi selama 5 menit pada suhu 40
o
C. Sampel berisi 1 ml filtrat enzim ditambah 1 ml substrat di vorteks dan diinkubasi selama 30 menit
pada suhun optimum. Selanjutnya DNS ditambahkan 3 ml, divorteks, dan dididihkan pada penangas air selama 15 menit. Kontrol dibuat dengan
menambahkan 3 ml DNS dinitrosalicylic acid dan 1 ml substrat ke dalam 1 ml filtrat enzim tanpa inkubasi. Blanko terdiri dari 1 ml buffer, 3 ml DNS dan 1 ml
substrat. Kontrol dan blanko dididihkan selama 15 menit, kemudian aktivitas mananase ditentukan dengan pengukuran absorban pada panjang gelombang 575
nm. Kemudian standar dibuat dengan 1 ml manosa dengan deret konsentrasi 0- 450 µgml dari larutan induk 1000 µgml dalam air, diencerkan dengan buffer,
kemudian ditambahkan 1 ml substrat dan 3 ml DNS, selanjutnya dididihkan 15 menit. Setelah absorban dingin, diukur pada panjang gelombang 575 nm. Kurva
standar dibuat dengan menghubungkan konsentrasi manosa dan absorban. Satu unit aktivitas enzim adalah banyaknya enzim yang dapat memproduksi 1 µmol
manosa per menit pada kondisi percobaan dengan formula sebagai berikut : Aktivitas Mananase µml = [glukosa]sampel – [glukosa] kontrol µgml x Fp
Waktu inkubasi x BM manosa Keterangan:
Fp=faktor pengenceran; Waktu inkubasi = 30 menit; Berat molekul manosa = 180
29
3.14 Rancangan Percobaan
