4 Selanjutnya masing-masing tabung diinkubasi di dalam waterbath dengan suhu 95
C selama 60 menit. 5 Setelah diinkubasi, masing-masing tabung dikeluarkan dari waterbath
dan setelah dingin masing-masing tabung disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm selama 10 menit.
6 Supernatan diambil
untuk selanjutnya
dianalisa dengan
spektrofotometer UV pada panjang gelombang 534 nm.
3.7.8.2. Pengamatan Gambaran Mikroskopis Tubulus Seminiferus Testis Mencit
Pengamatan gambaran mikroskopis diameter dan ketebalan epitel tubulus seminiferus testis mencit, dibuat sediaan histologis menurut Suntoro, S.H, 1983
dengan metode parafin, menggunakan pewarnaan HE Hematoksilin Eosin. Sesuai dengan cara yang lazim dikerjakan dalam pembuatan sediaan histologis yaitu: fiksasi,
pencucian, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi parafin, penanaman, pengirisan, penempelan, deparafinasi, pewarnaan, penutupan dan pemberian label.
Fikasasi
Jaringan testis diambil, kemudian difiksasi dalam larutan formalin selama 2-10 jam.
Pencucian
Setelah proses fiksasi dilakukan pencucian dengan alkohol 70.
Universitas Sumatera Utara
Dehidrasi
Dilakukan secara bertahap, dengan alkohol 70 selama 10 menit, alkohol 80, 90, 96, masing-masing selama 60 menit, kemudian dengan alkohol absolut
30 menit.
Penjernihan
Dilakukan segera setelah proses dehidrasi dengan menggunakan toluol murni.
Infiltrasi
Proses infiltasi parafin dilakukan di dalam oven dengan suhu 56ºC. Organ testis dimasukkan kedalam campuran toluol-parafin dengan perbandingan 1:1 selama
30 menit. Kemudian berturut dimasukkan kedalam:
Parafin Murni I selama 1 jam Parafin Murni II selama 1 jam
Parafin murni III selama 1 jam
Penanaman
Sediaan dari parafin murni III dimasukkan kedalam kotak kertas kecil sebagai cetakan yang telah berisi parafin cair, dan dibiarkan sampai parafin mengeras.
Pengirisan
Blok parafin testis yang telah mengeras ditempelkan pada holder dengan menggunakan spatula, letakkan holder beserta blok parafin pada tempatnya di
mikrotom. Pengirisan dilakukan dengan ketebalan ± 6µ m.
Universitas Sumatera Utara
Penempelan
Pada gelas benda diolesi dengan albumin dan ditetesi dengan akuades. Kemudian beberapa pipa parafin diletakkan di permukaan akuades pada gelas benda
dan dibiarkan beberapa saat, kemudian gelas benda dipindahkan ke meja pemanas hingga kering.
Pewarnaan
Pewarnaan dengan hematoxylin-Eosin H-E melalui tahapan: •
Deparafinisasi preparat dengan xylol sampai bebas parafin •
Hidrasi dengan alkohol 96, 90, 80, 70, 50, 30, akuades •
Inkubasi dalam larutan haematoxylin Erlich selama 30 menit •
Cuci dengan air mengalir ± 10 menit •
Dicelupkan kedalam akuades •
Dimasukkan alkohol 30, 50, 70 •
Kemudian dimasukkan kedalam larutan Eosin 0,5 selama 3 menit •
Dehidrasi dengan alkohol mulai dari 70, 80, 90 dan alkohol absolut •
Dikeringkan dengan kertas penghisap •
Inkubasi dengan xylol selama 1 malam •
Preparat ditutup dengan gelas penutup setelah ditetesi dengan kanada balsem terlebih dahulu, lalu diberi label.
Pewarnaan dengan hematoksilin-eosin HE yang akan menyebabkan inti berwarna hitam kebiru-biruan dan sitoplasma berwarna merah. Selanjutnya dilakukan
Universitas Sumatera Utara
pemeriksaan histopatologis dengan menggunakan mikroskop cahaya. Pengamatan gambaran kerusakan tubulus seminiferus
meliputi tebal epitel tubulus seminiferus dan diameter dari tubulus seminiferus. Hanya tubulus seminiferus yang penampang
melintangnya tampak bulat yang dipilih untuk diamati. Dengan pembesaran 10x pengukuran tebal dan diameter tubulus seminiferus dilakukan dengan mengukur jarak
terdekat antara 2 titik yang bersebrangan pada garis tengahnya. Kedua titik tersebut berada pada batas antara membrana basalis dengan sel spermatogenik. Pengukuran
tebal epitel tubulus seminiferus juga dimulai dari titik tersebut sampai kepermukaan lumen. Hasil pengukuran dinyatakan dalam satuan mikrometer µm.
3.8. Analisa Data dan Pengujian Hipotesis
