Rancangan Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Definisi operasional Etika Penggunaan Hewan Penelitian Analisa Data dan Pengujian Hipotesis

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Rancangan Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental yang didisain mengikuti Rancangan Acak Lengkap RAL. Jumlah hewan uji perkelompok ditentukan dengan rumus t-1 n-1 ≥ 15. Jika t adalah perlakuan dalam hal ini ada 6 kelompok perlakuan n adalah jumlah ulangan perkelompok, maka jumlah n yang diharapkan teoritis adalah 4 Federer, 1963.

3.2. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium FMIPA Biologi USU Medan, Laboratorium terpadu FK USU Medan, Laboratorium Patologi Anatomi FK USU Medan, Laboratorium Farmasi MIPA USU Medan dan Laboratorium Biomedik FK USU. Penelitian dilakukan selama 8 minggu. 3.3. Bahan dan Alat Penelitian 3.3.1. Bahan Penelitian Bahan biologis. Bahan biologis yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan Mus musculus L. strain DD Webster yang sehat, umur 8-11 Universitas Sumatera Utara minggu, belum pernah digunakan untuk percobaan lain dan mempunyai berat badan antara 25- 35 gram yang diperoleh dari FMIPA Biologi USU Medan. Bahan Kimia Ekstrak air rimpang jahe, aquadest, Plumbum asetat Merck , formalin 10, Alkohol 70, 80, 90, 96 dan alkohol absolut, parafin, xylol, Hematoxylin-Eosin, kit pemeriksaan Malondialdehid Oxitek. Reagensia : 1. 2-Thiobarbiturat acid 2. 1,1,3,3-terramethoxypropane 99 , 600 µM 3. Acetic acid glacial 4. Sodium hydroxide NaOH

3.3.2. Alat-alat Penelitian

Jarum oval Gavage, spuit 1 ml, bak bedah dan dissecting set, gelas arloji, cawan peteri, batang pengaduk, waterbath, timbangan merek OHAUSS, timbangan merek Sartorius, vertex, mixer, sentrifuse effendrop, spektrofotometri, labu ukur, labu Erlenmeyer, Buret, mikroskop cahaya merek Olympus. 3.4. Variabel Penelitian 3.4.1 Variabel independent • Plumbum asetat • Ekstrak air Jahe Universitas Sumatera Utara

3.4.2 Variabel dependent

• Kadar MDA testis mencit • Gambaran histopatologis: - diameter tubulus seminiferus mencit - tebal epitel tubulus seminiferus mencit.

3.5. Definisi operasional

• Plumbum asetat : merupakan suatu logam berat dengan rumus kimia PbC 2 H 3 O 2 ·3H 2 O. • Ekstrak air jahe : rimpang jahe segar yang di olah menjadi ekstrak air jahe dengan cara maserasi • Kadar malondialdehid MDA : jumlah kadar MDA mikromol dalam jaringan testis g. • Gambaran histopatologis jaringan : pemeriksaan terhadap perubahan- perubahan abnormal pada tingkat jaringan secara mikro anatomi.

3.6. Etika Penggunaan Hewan Penelitian

Penggunaan dan penanganan hewan penelitian dilakukan sesuai dengan aturan etika penelitian hewan penelitian yang diatur dalam Deklarasi Helsinki untuk memperoleh “ethical clearance” dari komite etik penelitian hewan FMIPA Biologi Universitas Sumatera Utara Medan lampiran 6. Universitas Sumatera Utara 3.7. Pelaksanaan Penelitian 3.7.1. Pemeliharaan Hewan Percobaan Mencit ditempatkan di dalam kandang yang terbuat dari bahan plastik ukuran 30x20x10 cm yang ditutup dengan kawat kasa. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5-1 cm dan diganti setiap tiga hari. Cahaya ruangan dikontrol persis 12 jam terang pukul 06.00 sampai dengan pukul 18.00 dan 12 jam gelap pukul 18.00 sampai dengan pukul 06.00, sedangkan suhu dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Pakan pellet komersial dan minum air PAM diberikan ad libitum setiap hari. Percobaan dimulai setelah aklimatisasi.

3.7.2. Sampling Ekstrak Jahe Zingiber officinale

Rimpang jahe yang digunakan untuk penelitian ini diambil dari daerah sidikalang desa sumbul pegaga.

3.7.3. Pembuatan Ekstrak Jahe

- Rimpang jahe dibersihkan, kemudian diiris tipis dengan ketebalan ± 1- 2 mm, dikering anginkan, di timbang lalu dihaluskan dengan blender sampai menjadi serbuk. - Serbuk jahe dimaserasi dengan aquadest selama ± 48 jam, sampai didapat cairan bening. Hasil maserasi dipekatkan dengan waterbath sampai diperoleh ekstrak yang Universitas Sumatera Utara pekat, kemudian ekstrak pekat ini di fresh dryer hingga menjadi ekstrak kering Hartanto, 2008. Lampiran A.

3.7.4. Uji Kandungan Kimia ekstrak Jahe

Uji yang dilakukan pada penelitian ini dengan menggunakan metode fitokimia Adalah sebagai berikut: - Uji zat fenolik dilakukan dengan cara menambahkan ekstrak jahe dengan FeCl 3 , hasil uji positif mengandung zat fenolik jika terbentuk larutan hitam pada sampel. - Uji zat flavonoid dilakukan dengan menggunakan Mg-HCl encer yang ditambahkan dengan ekstrak jahe, hasil uji positif mengandung zat flavonoid jika terbentuk larutan berwarna merah jambu pada sampel. - Uji zat alkoloid dilakukan dengan menggunakan pereaksi Wagner, pereaksi Meyer, dan pereaksi Dragendorff. Ekstrak jahe ditambahkan dengan masing-masing pereaksi, hasil uji positif mengandung zat alkoloid jika terbentuk endapan berwarna putih pada sampel. - Uji zat steroid dilakukan dengan menggunakan H 2 SO 4 dan pereaksi LB Lieberman- Burchad. Ekstrak jahe ditambahkan dengan masing-masing zat. Uji dengan cara menambahkan ekstrak jahe dengan H 2 SO 4 , hasil uji positif jika terbentuk larutan berwarna merah pada sampel. Dan uji dengan cara menambah ekstrak jahe dengan pereaksi LB Lieberman-Burchard, hasil uji positif jika terbentuk larutan berwarna hijau kebiruan pada sampel. Universitas Sumatera Utara - Uji zat saponin dilakukan dengan cara menambahkan ekstrak jahe dengan akuades, lalu dikocok sampai terbentuk buih, hasil uji positif jika buih yang dihasilkan setelah didiamkan selama 15 menit tetap ada dan tinggi buih yang dihasilkan ± 2cm Harborne, 1987.

3.7.5. Perhitungan Dosis Ekstrak Jahe dan Plumbum asetat

Dosis plumbum asetat yang digunakan sebesar 100 mgKgBB sesuai dengan penelitian Daniel 2008. Penentuan dosis ekstrak jahe pada mencit berdasarkan dosis ekstrak jahe yang aman bagi sistem reproduksi tikus jantan yaitu sebesar 500mgKgBB dan 1000mgKgBB dengan berat badan tikus yang digunakan ± 200 gram Morakinyo et al, 2008. Pemberian dosis ekstrak jahe untuk mencit dengan menggunakan tabel konversi dosis Harmita, 2008Lampiran 5 Angka konversi dari tikus dengan berat badan 200 g ke mencit dengan berat badan 20 g yaitu sebesar 0,14g . Dengan demikian perhitungan dosis ekstrak jahe adalah: - 500mgKgBB = 0,5 mggBB ¢ 0,5 x 200 = 100 mg200gBB tikus 100 x 0,14 = 14mg20 gBB mencit = 0,7mggBB mencit - 1000mgKgBB = 1 mggBB ¢ 1 x 200 = 200 mg200gBB tikus 200 x 0,14 = 28 mg20 gBB mencit = 1,4 mggBB mencit. Universitas Sumatera Utara Maka dosis ekstrak jahe yang digunakan dalam penelitian ini sebesar 0,7mggBB dan 1,4mggBB. Pemberian Ekstrak jahe dan Plumbum asetat diberikan masing-masing sebanyak 0,5 ml, hal ini berdasarkan bahwa volume maksimum larutan yang diberikan pada mencit dengan berat 20-30g per oral adalah sebanyak 1 ml Harmita, 2008.

3.7.6. Perlakuan Hewan Percobaan

Jumlah keseluruhan hewan coba yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah sebanyak 24 ekor. Penelitian ini terdiri atas 6 kelompok perlakuan, yaitu: a Kelompok I P0 = terdiri dari 4 ekor mencit jantan dewasa yang diberi aquadest sebanyak 0,5 ml secara oral selama 42 hari. b Kelompok II P1 = terdiri dari 4 ekor mencit jantan dewasa yang diberi ekstrak jahe 0,7 mggBB diberikan secara oral per hari selama 42 hari. c Kelompok III P2 = terdiri dari 4 ekor mencit jantan dewasa yang diberi ekstrak jahe 1,4mggBB diberikan secara oral per hari selama 42 hari. d Kelompok IV P3 = terdiri dari 4 ekor mencit jantan dewasa yang diberi plumbum asetat 0,1 mggBB diberikan secara oral per hari selama 42 hari. e Kelompok V P4 = terdiri dari 4 ekor mencit jantan dewasa yang diberi ekstrak jahe 0,7 mggBB diberikan secara oral, satu jam kemudian Universitas Sumatera Utara diberi plumbum asetat 0,1 mggBB diberikan secara oral per hari selama 42 hari. f Kelompok VI P5 = terdiri dari 4 ekor mencit jantan dewasa yang diberi ekstrak jahe 1,4mggBB diberikan secara oral, satu jam kemudian diberi plumbum asetat 0,1 mggBB diberi secara oral per hari selama 42 hari. Tabel 2. Perlakuan Hewan Coba Kelompok Aquadest Ekstrak Jahe Pb Asetat Perlakuan Lamanya pemberian P0 0,5 mloral 42 hari P1 0,7 mggBBoral 42 hari P2 1,4 mggBBoral 42 hari P3 0,1mggBBoral 42 hari P4 0,7 mggBBoral 0,1mggBBoral 42 hari P5 1,4 mggBBoral 0,1mggBBoral 42 hari

3.7.7. Prosedur Pelaksanaan Uji Pengaruh Pemberian Ekstrak Jahe

Sebelum percobaan, mencit jantan ditimbang dan ditempatkan dalam kandang tersendiri di dalam ruangan laboratorium aklimatisasi. Mencit dibagi secara acak ke dalam 6 kelompok perlakuan, seperti yang ditunjukkan pada gambar 5. Universitas Sumatera Utara Hari 0 7 49 Perlakuan pada hewan percobaan selama 42 hari n = 4 n = 4 n = 4 n = 4 n = 4 n = 4 Ekstrak jahe Aquadest Pb asetat 1,4mggBBoral 0,5 mlhari Ekstrak jahe 0,1mggBBoral per oral 0,7mggBBoral Ekstrakjahe 1 jam Ekstrak jahe 0,7mggBBoral 1,4mggBBoral 1 jam Pb asetat 0,1mggBBoral Pb asetat 0,1mggBBoral Gambar 5. Prosedur pelaksanaan uji pengaruh ekstrak jahe Aklimatisasi Perlakuan pada hewan percobaan Dekapitasi Pembedahan P0 P5 P2 P3 P4 P1 Pada hari ke 43 mencit didekapitasi dan dilakukan pemeriksaan: § MDA testis • Histologi jaringan testis : - Diameter tubulus seminiferus - Tebal epitel tubulus seminiferus Universitas Sumatera Utara

3.7.8. Prosedur Pemeriksaan dan Pengamatan

Setelah 42 hari perlakuan, masing-masing hewan coba dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dilakukan pembedahan dengan cara mencit diletakkan pada bak bedah dengan keempat anggota gerak terfiksasi. Scrotum dibuka dengan gunting hingga tampak testis. Testis dianggkat dengan memotong duktus epididimis. Setelah dikeluarkan maka testis dibersihkan dari jaringan ikat dan lemak. Kemudian dilakukan pengamatan sebagai berikut :

3.7.8.1. Pengamatan kadar MDA Testis mencit

Pemeriksaan kadar MDA testis mencit dilakukan pada hari ke-42 setelah perlakuan pada semua kelompok. Testis dihomogenkan dalam 5 ml larutan buffer phosphate pH 7,2. Metode pemeriksaan MDA menurut Rao et al., dan Hsieh et al, 2006 yang telah dimodifikasi sebagai berikut : • Reagensia : 1 2-Thiobarbiturat acid Merck.Cat. No. 1.08180.0025 2 1,1,3,3-terramethoxypropane 99 , 600 µM 3 Acetic acid glacial 4 Sodium hydroxide NaOH 5 Aquadest Universitas Sumatera Utara a Persiapan Reagensia • TBABuffer Reagent TBABuffer Reagent terdiri dari : 0,67 g 2-thiobarbituric acid dilarutkan dalam 100 mL aquadest, selanjutnya 0,5 g sodium hydroxide dan 100 asam asetat glacial. • Standard MDA Sebanyak 250 µL 1,1,3,3-tetramethoxypropane Malondialdehid bis 500 µM dilarutkan dalam 750 µL aquadest untuk memperoleh larutan stok MDA 125 µM. Selanjutnya dari larutan stok MDA 125 µM dilarutkan dalam aquadest dan dibuat 8 seri standar yang dapat dilihat pada table di bawah ini : Tabel 3. Persiapan standar MDA untuk spektrofotometri Nomor standar Konsentrasi MDA µM Volume MDA Standar µL Volume pelarut µL 8 7 6 5 4 3 2 1 50 25 10 5 2,5 1,25 0,625 400 200 80 40 20 10 5 600 800 920 960 980 990 995 1000 a Prosedur uji 1 Sebanyak 500 µ L sample atau standar MDA dimasukkan dalam tabung ependorf yang masing-masing telah diberi label. 2 Ditambahkan 0,5 ml aquadest pada masing-masing tabung. 3 Kemudian ditambahkan 0,5 ml TBABuffer Reagent. Universitas Sumatera Utara 4 Selanjutnya masing-masing tabung diinkubasi di dalam waterbath dengan suhu 95 C selama 60 menit. 5 Setelah diinkubasi, masing-masing tabung dikeluarkan dari waterbath dan setelah dingin masing-masing tabung disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm selama 10 menit. 6 Supernatan diambil untuk selanjutnya dianalisa dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 534 nm.

3.7.8.2. Pengamatan Gambaran Mikroskopis Tubulus Seminiferus Testis Mencit

Pengamatan gambaran mikroskopis diameter dan ketebalan epitel tubulus seminiferus testis mencit, dibuat sediaan histologis menurut Suntoro, S.H, 1983 dengan metode parafin, menggunakan pewarnaan HE Hematoksilin Eosin. Sesuai dengan cara yang lazim dikerjakan dalam pembuatan sediaan histologis yaitu: fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi parafin, penanaman, pengirisan, penempelan, deparafinasi, pewarnaan, penutupan dan pemberian label. Fikasasi Jaringan testis diambil, kemudian difiksasi dalam larutan formalin selama 2-10 jam. Pencucian Setelah proses fiksasi dilakukan pencucian dengan alkohol 70. Universitas Sumatera Utara Dehidrasi Dilakukan secara bertahap, dengan alkohol 70 selama 10 menit, alkohol 80, 90, 96, masing-masing selama 60 menit, kemudian dengan alkohol absolut 30 menit. Penjernihan Dilakukan segera setelah proses dehidrasi dengan menggunakan toluol murni. Infiltrasi Proses infiltasi parafin dilakukan di dalam oven dengan suhu 56ºC. Organ testis dimasukkan kedalam campuran toluol-parafin dengan perbandingan 1:1 selama 30 menit. Kemudian berturut dimasukkan kedalam: Parafin Murni I selama 1 jam Parafin Murni II selama 1 jam Parafin murni III selama 1 jam Penanaman Sediaan dari parafin murni III dimasukkan kedalam kotak kertas kecil sebagai cetakan yang telah berisi parafin cair, dan dibiarkan sampai parafin mengeras. Pengirisan Blok parafin testis yang telah mengeras ditempelkan pada holder dengan menggunakan spatula, letakkan holder beserta blok parafin pada tempatnya di mikrotom. Pengirisan dilakukan dengan ketebalan ± 6µ m. Universitas Sumatera Utara Penempelan Pada gelas benda diolesi dengan albumin dan ditetesi dengan akuades. Kemudian beberapa pipa parafin diletakkan di permukaan akuades pada gelas benda dan dibiarkan beberapa saat, kemudian gelas benda dipindahkan ke meja pemanas hingga kering. Pewarnaan Pewarnaan dengan hematoxylin-Eosin H-E melalui tahapan: • Deparafinisasi preparat dengan xylol sampai bebas parafin • Hidrasi dengan alkohol 96, 90, 80, 70, 50, 30, akuades • Inkubasi dalam larutan haematoxylin Erlich selama 30 menit • Cuci dengan air mengalir ± 10 menit • Dicelupkan kedalam akuades • Dimasukkan alkohol 30, 50, 70 • Kemudian dimasukkan kedalam larutan Eosin 0,5 selama 3 menit • Dehidrasi dengan alkohol mulai dari 70, 80, 90 dan alkohol absolut • Dikeringkan dengan kertas penghisap • Inkubasi dengan xylol selama 1 malam • Preparat ditutup dengan gelas penutup setelah ditetesi dengan kanada balsem terlebih dahulu, lalu diberi label. Pewarnaan dengan hematoksilin-eosin HE yang akan menyebabkan inti berwarna hitam kebiru-biruan dan sitoplasma berwarna merah. Selanjutnya dilakukan Universitas Sumatera Utara pemeriksaan histopatologis dengan menggunakan mikroskop cahaya. Pengamatan gambaran kerusakan tubulus seminiferus meliputi tebal epitel tubulus seminiferus dan diameter dari tubulus seminiferus. Hanya tubulus seminiferus yang penampang melintangnya tampak bulat yang dipilih untuk diamati. Dengan pembesaran 10x pengukuran tebal dan diameter tubulus seminiferus dilakukan dengan mengukur jarak terdekat antara 2 titik yang bersebrangan pada garis tengahnya. Kedua titik tersebut berada pada batas antara membrana basalis dengan sel spermatogenik. Pengukuran tebal epitel tubulus seminiferus juga dimulai dari titik tersebut sampai kepermukaan lumen. Hasil pengukuran dinyatakan dalam satuan mikrometer µm.

3.8. Analisa Data dan Pengujian Hipotesis

Data dipresentasikan dalam bentuk rata-rata ± simpangan baku rata-rata ± SD. Dilakukan uji normalitas dan homogenitas data. Jika data berdistribusi normal dan homogen maka dilakukan uji ANOVA. Bila terdapat perbedaan dilakukan dengan uji Post Hoc untuk melihat perbedaan antar kelompok kontrol dan masing- masing perlakuan. Jika distribusi data tidak normal dan atau tidak homogen, maka dilakukan transformasi data. Kemudian diuji lagi normalitas dan homogenitas data. Apabila data masih tidak normal distribusinya atau tidak homogen maka diuji dengan uji Kruskal- Wallis. Untuk melihat perbedaan antar kelompok kontrol dan kelompok perlakuan mengunakan uji Mann Whitney. Semua analisis data dilakukan dengan Universitas Sumatera Utara menggunakan SPSS 13,0. Dalam penelitian ini, hanya perbedaan rata-rata pada α ≤ 0,05 yang dianggap bermakna signifikan.

3.9. Jadwal Penelitian