Menghitung populasi

14.5. Menghitung populasi

e) Tujuan pengenceran media

mikroba

dari 1/10, 1/100, 1/1000, Populasi mikroba dapat dihitu- 1/10.000 dst adalah apabila

ngan dengan dua cara, yaitu tiap media pengenceran di-

menghitung secara langsung dan menghitung secara langsung dan

penghitung (counting cham- pelarut yang digunakan, suhu,

ber). Kotak penghitung terdiri dan lama proses inkubasi. dari kotak-kotak kecil dengan ukuran dan luas tertentu.

Media yang umum digunakan Cairan contoh yang diketahui berupa air steril, air garam steril,

volumenya, diletakan di kotak buffer fosfat steril, dan 0.1 %

penghitung dan ditutup de- pepton steril. Penggunaan air

ngan gelas penutup. Dengan steril dan garam steril dapat

volume contoh yang diketahui merusak beberapa bakteri. Ba-

dan jumlah mikroba pada tiap han pangan dari laut membutuh-

kotak pada kotak penghitung kan pelarut 3 % NaCl, karena

diketahui, maka populasi mi- beberapa mikroba membutuhkan

kroba dapat diketahui garam.

b. Menghitung jumlah sel total secara mikroskopis dengan

Suhu inkubasi berpengaruh ter- menggunakan contoh yang hadap hasil penghitungan popu-

telah diwarnai. lasi mikroba. Suhu inkubasi ber-

kisar 25 o – 30

C memberikan ha- Kelemahan dari penghitungan sil perhitungan yang lebih tinggi o

populasi mikroba secara lang- dibandingkan suhu 37

sung antara lain : hendak menumbuhkan Pseudo-

C. Apabila

a. Sel mikroba yang sudah mati monas atau Bacillus, maka pro-

tidak dapat dibedakan dari ses inkubasi sebaiknya menggu-

yang masih hidup nakan suhu rendah.

b. Sel yang berukuran kecil sulit dihitung atau terlewat sehing-

Penghitungan mikroba secara

ga hasil perhitungan membe- langsung dapat dilakukan dengan

rikan hasil dibawah angka se- cara :

benarnya.

c. Kurang peka karena suspensi contoh harus mengandung 6

14.5.1 menghitung jumlah sel

minimal 10 sel per ml.

mikroba yang terlihat di

d. Ketepatan yang tinggi sukar

bawah mikroskop.

diperoleh.

Jumlah sel mikroba yang terlihat

e. Suspensi contoh harus bebas di bawah mikroskop dapat dihi-

dari zat lain karena dapat me- tung dengan cara :

nutupi sel pada saat dihitung.

a. Menghitung secara mikrosko- pis jumlah mikroba dalam co-

14.5.2 Menghitung sel hidup

ntoh dengan volume yang Jumlah mikroba yang hidup dapat sangat sedikit dan terukur.

dihitung menggunakan metode Penghitungan dilakukan de-

penghitungan secara langsung penghitungan secara langsung

bentuk pola angka delapan agar kroba yang hidup terhadap waktu

contoh tersebar merata di seluruh (Total Plate Count) atau

media agar. Inkubasikan di da- Menghitung mikroba secara tidak

lam inkubator. Metode ini paling langsung berdasarkan turbiditas.

peka karena mampu menghitung Prosedurnya lebih cepat namun

mikroba sampai kepadatan 20 harus membuat kurva standarnya

sel/ml. Metode ini kurang praktis terlebih dahulu.

digunakan di lapangan karena membutuhkan peralatan untuk

14.5.2.1 Pertumbuhan dalam

mencairkan dan membekukan

agar

media agar.

Berdasarkan anggapan bahwa satu sel mikroba akan tumbuh

Pada cara penyebaran, 0.1 ml dan berkembang menjadi popula-

contoh disebar secara merata di si, maka prinsip dasar dari meng-

permukaan media agar (spread hitung mikroba adalah satu koloni

plate method) dengan menggu- mikroba mewakili satu sel mikro-

nakan tongkat gelas melengkung

ba. (bent glass rod). Selanjutnya dilakukan inkubasi di dalam

Sampel dari bahan atau produk inkubator. Metode ini dapat digu- pangan yang sudah dihomogeni-

nakan di lapangan karena media sasi diinokulasi ke dalam atau

agarnya sudah disiapkan terlebih permukaan media agar. Setelah

dahulu. Jumlah mikroba yang diinkubasi, koloni mikroba yang

dapat dihitung dengan metode ini tumbuh dihitung sebagai jumlah

harus mempunyai kepadatan mi- mikroba.

nimal 300 sel/ml.

Proses inokulasi contoh ke media Pada cara penetesan, media agar dapat dilakukan dengan ca-

agar pada cawan petri dibagi ra penuangan, penyebaran, dan

menjadi 3-4 sektor dengan mem- penetesan.

beri garis di dasar cawan petri. Pada cara penuangan, 1 ml

Larutan contoh sebanyak 0.02 ml contoh dipindahkan ke dasar

diteteskan di masing-masing sek- cawan petri dan 15-20 ml media

tor. Setelah contoh mengering, agar cair dituangkan di atasnya.

lakukan inkubasi di dalam inku- Untuk mencegah kematian mi-

bator. Keuntungan dari metode kroba contoh, suhu media agar

ini adalah proses penghitungan cair yang dituangkan berkisar

dapat diulang sesuai jumlah sek-

C. Bila suhunya terlalu tor yang dibuat. rendah akan menyulitkan karena sudah mulai mengental. Selan-

45 o – 50

Keuntungan dari metode pertum- jutnya cawan petri digeserkan di

buhan agar adalah dapat diketa- buhan agar adalah dapat diketa-

nya membutuhkan waktu 24 diketahui adanya mikroba jenis

jam atau lebih lain yang terdapat dalam contoh.

Adapun kelemahan dari metode

14.5.2.2 Penyaringan dengan

ini adalah :

membran

1. Kemungkinan terjadinya kolo- Pada metode penyaringan de- ni yang berasal lebih dari satu

ngan membran (membrane filtra- sel mikroba, seperti pada

tion), larutan contoh disaring mikroba yang berpasangan,

dengan menggunakan membran rantai atau kelompok sel.

steril atau filter dengan pori-pori Kemungkinan ini akan mem-

yang cukup untuk menahan mi- perkecil jumlah sel mikroba

kroba. Membran dengan ukuran yang sebenarnya.

lubang 0.45 µ dapat digunakan

2. Kemungkinan adanya jenis untuk menghitung bakteri dan mikroba yang tidak dapat

kamir.

tumbuh karena penggunaan jenis media agar, suhu, pH,

Membran selanjutnya dipindah- atau kandungan oksigen se-

kan secara aseptis ke cawan lama masa inkubasi.

steril berisi kertas saring yang

3. Kemungkinan ada jenis mi- dijenuhkan dengan media nutrien kroba tertentu yang tumbuh

cair. Membran juga dapat dipin- menyebar di seluruh permu-

dahkan ke media nutrisi dalam kaan media agar sehingga

cawan petri. Bagian membran menghalangi mikroba lain.

yang ada mikrobanya mengha- Hal ini akan mengakibatkan

dap ke atas. Selanjutnya lakukan mikroba lain tersebut tidak

inkubasi agar koloni yang tumbuh terhitung.

di permukaan kertas saring dapat

4. Penghitungan dilakukan pada

dihitung.

media agar yang jumlah po- pulasi mikrobanya antara 30 –

Beberapa keuntungan dari meto- 300 koloni. Bila jumlah popu-

de penyaringan dengan membran lasi kurang dari 30 koloni

adalah :

akan menghasilkan penghitu-

a. Metode ini sangat peka kare- ngan yang kurang teliti secara

na dapat menghitung sel mi- statistik, namun bila lebih dari

kroba hingga kepadatan 5 300 koloni akan menghasil-

sel/100 ml. kan hal yang sama karena

b. Proses penyaringan berlang- terjadi persaingan diantara

sung cukup cepat koloni.

5. Penghitungan populasi mikro- Sedangkan kelemahan dari meto-

ba dapat dilakukan setelah

de ini adalah tersumbatnya mem- de ini adalah tersumbatnya mem-

Bila 1 ml larutan A, B, C, dan D seperti air dan minuman, dari-

dipindahkan ke tabung berisi pada homogenat bahan pangan.

kaldu nutrien (nutrient broth) akan selalu ditemukan pertumbuhan.

Namun pada larutan E akan dite- Teknik Most Probable Number

14.5.2.3 Teknik MPN

mukan hanya sekali dalam dalam (MPN) banyak digunakan untuk

sepuluh kali pemindahan larutan menghitung populasi mikroba da-

ke kaldu nutrien. lam bahan atau produk pangan. Penghitungan mikroba dengan

Dari masing-masing larutan di teknik MPN merupakan kombi-

atas, pindahkan ke tiga atau lima nasi antara pertumbuhan popula-

tabung berisi kaldu nutrien. Ma- si mikroba dan Tabel Mc Crady.

sing-masing tabung mendapat 1 ml. Masing-masing tabung diin-

Teknik MPN didasarkan pada kubasi dan diamati apakah ada pengenceran contoh. Prinsipnya,

pertumbuhan. bila contoh diencerkan terus me- nerus maka akhirnya akan diper-

Tabung dengan kelarutan terting- oleh larutan yang tidak mengan-

gi, dimana tiga tabung memperli- dung mikroba (steril). Teknik ini

hatkan pertumbuhan positif dica- akan memberikan hasil baik bila

tat bersama dengan hasil yang asumsinya terpenuhi, yaitu : 1)

diperoleh pada dua pengenceran sel mikroba tersebar merata

berikutnya. Misalnya ketiga ta- dalam contoh dimana gaya tarik

bung yang memperlihatkan per- atau tolak diantara mikroba tidak

tumbuhan positif didapat pada -3 terjadi; 2) larutan yang diinokulasi

pengenceran 10 , maka penga- ke kaldu nutrien akan memper-

matan pertumbuhan dilakukan lihatkan pertumbuhan positif apa-

pada tabung dengan pengencer-

bila mengandung satu atau lebih -5 an 10 dan 10 . Bila pada mikroba hidup; dan 3) terhindar -4 pengenceran 10 menunjukkan dari pencemaran yang berasal

dua dari tiga tabung positif tum- dari bahan dan peralatan. -5 buh dan pada pengenceran 10

tidak dijumpai tabung yang positif Dalam prakteknya, apabila con-

tumbuh, maka diperoleh hasil 3/3, toh A mengandung 1000 sel/ml

2/3, dan 0/3. Hasil pembacaan diencerkan 10 kali, maka akan

dengan menggunakan tabel Mc dihasilkan larutan B dengan kan-

Crady dapat diketahui konsen- dungan 100 sel/ml. Bila diencer-

trasi mikroba dalam contoh. kan lebih lanjut, maka akan diha- silkan larutan C, D, dan E dengan

Beberapa keuntungan dari meto- kandungan 10 sel/ml, 1 sel/ml,

de MPN ini adalah 1) dapat dibu- de MPN ini adalah 1) dapat dibu-

a. Tidak ada media yang seratus ml/tabung; 2) dapat digunakan

persen selektif, selalu ada dilapangan karena media dapat

mikroba lain yang tumbuh. disipkan sebelumnya; dan 3)

Penambahan komponen ter- untuk tujuan tertentu dapat meng-

tentu akan memberikan per- gunakan media pertumbuhan se-

bedaan berupa warna atau lektif sehingga hanya mikroba

bentuk morfologi. Agar bis- yang diharapkan dapat tumbuh

muth sulfit adalah media baik.

selektif bagi Salmonella, di- mana koloninya terlihat hitam

Kelemahan utama dari metode dan dilingkari warna kaca MPN adalah ulangannya banyak

mengkilat dari endapan bis- sehingga membutuhkan waktu

muth.

dan biaya lebih besar untuk

b. Beberapa mikroba terdapat persiapannya. Dengan kondisi

dalam jumlah sangat sedikit demikian, teknik MPN banyak

sehingga tidak dapat dihitung digunakan untuk menghitung

keberadaannya dengan me- bakteri patogen.

nggunakan teknik pertumbuh- an sebelumnya. Untuk me-

ngetahui keberadaan mikroba Dalam kondisi tertentu diperlukan

14.5.2.4 Penghitungan selektif

tersebut perlu dilakukan pe- penghitungan mikroba secara

mupukan selektif (selective selektif (selective counting tech-

enrichment) dengan cara niques), misalnya untuk mengeta-

menginokulasikan contoh ke hui populasi bakteri pembusuk

dalam media cair tertentu atau patogen tertentu. Pada

yang komposisinya telah di- prinsipnya pekerjaan ini dapat

buat sedemikian rupa hingga dilakukan secara mudah dengan

dapat menumbuhkan mikroba menggunakan media selektif.

yang diharapkan. Setelah Media selektif adalah media agar

masa inkubasi selesai, contoh yang mengandung zat terpilih se-

yang telah dipupuk ditumbuh- hingga dapat menghambat per-

kan ke dalam media agar tumbuhan mikroba yang tidak

diferensial selektif yang dapat diinginkan namun memberi

membedakan pertumbuhan kesempatan bagi mikroba yang

mikroba diinginkan dengan dimaksud untuk berkembang.

mikroba lainnya. Contoh me- Prosedur yang dilakukan sama

dia pemupukan selektif untuk seperti inokulasi dengan meng-

Salmonella adalah tetrathio- gunakan kultur murni.

net broth. Media ini mengan- dung ion tetrathionat yang

Beberapa hal yang perlu akan menekan pertumbuhan diperhatikan dalam penghitungan

mikroba lain.

c. Kerusakan sublethal § Sebagian mikroba yang terdapat dalam produk pangan sudah mengalami

kerusakan fisiologis dan biokimia akibat proses pengolahan, sehingga ti- dak dapat hidup secara normal. Mikroba ini tidak bisa tumbuh pada media selektif namun masih da- pat tumbuh pada media tidak selektif. Salmonella yang mengalami kerusak- an subletal akibat pengo- lahan dapat tumbuh pada media nutrien agar tetapi tidak dapat tumbuh pada media selektif, karena pe- ka terhadap senyawa pi- lihan yang digunakan da- lam media selektif.

§ Untuk menghitung popula- si Salmonella sublethal,

tumbuhkan dahulu dalam kaldu nutrien agar kerusa- kan sublethal yang bersi- fat sementara dapat di- sembuhkan dan Salmo- nella tumbuh menjadi sel normal. Jangka waktu yang diperlukan cukup 1 –

2 jam dan selanjutnya ino- kulasikan ke media selek- tif.