27
3. Sel absorpsi, pada pengukuran di daerah tampak kuvet kaca atau kuvet kaca
corex dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah UV kita harus menggunakan sel kuarsa karena gelas tidak tembus cahaya pada daerah ini.
Umumnya tebal kuvetnya adalah 10 mm, tetapi yang lebih kecil ataupun yang lebih besar dapat digunakan. Sel yang biasa digunakan berbentuk persegi,
tetapi bentuk silinder juga dapat digunakan. Kita harus menggunakan kuvet yang bertutup untuk pelarut organik. Sel yang baik adalah kuarsa dan gelas
hasil leburan serta seragam keseluruhannya. 4.
Detektor, peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. Underwood,2002
Syarat-syarat senyawa yang dapat dianalisis menggunakan UV-VIS yaitu : 1
Bahan mempunyai gugus kromofor UV 2
Bahan tidak mempunyai gugus kromofor tapi berwarna Visible 3
Bahan tidak mempunyai gugus kromofor tidak berwarna, ditambahkan pereaksi warna Visible
4 Bahan tidak mempunyai gugus kromofor dibuat turunannya yang
mempunyai gugus kromofor UV.
2.4.3. Metode Pengukuran Kadar β-glukan
1. Megazyme
Megazyme adalah salah satu perusahaan yang memproduksi enzim. Salah satu enzim yang diproduksi digunakan untuk menentukan kemurnian
β-glukan yang berasal dari jamur. Mekanisme uji kemurnian
β-glukan adalah sebagai berikut; senyawa hasil ekstraksi dari jamur dihidrolisis dengan menggunakan HCl
28
pekat menjadi D-glukosa dengan bantuan enzim Exo-1,3-Glucanase, setelah terhidrolisis D-glukosa diinkubasi menggunakan glukosa oksidase dan kemudian
berubah menjadi D-glukonat dan peroksidase. Adanya enzim peroksidase dan penambahan p-hydroxibenzoic acid serta 4 aminoantipyrine, akan mengubah D-
glukonat menjadi quinoneimine dye yang berwarna merah. Senyawa tersebut dapat diukur dengan menggunakan UV-Visibel spektrofotometer pada panjang
gelombang 510 nm Barry, 2009. Uji Kemurnian
β-glukan dengan metode megazyme dilakukan dengan dua tahap yaitu pengukuran total glukan dan pengukuran
α-glukan dari ekstrak sampel. Untuk penentuan kadar kemurnian
β-glukan dilakukan dengan cara persentase total glukan dikurangi dengan persentase
α-glukan, maka akan didapat persentase kemurnian dari senyawa
β-glukan yang terkandung dalam ekstrak sampel. Selain pengukuran sampel dilakukan juga pengukuran terhadap standar
yaitu yeast yang telah tersedia dalam paket bersama enzim. Pengukuran ini dilakukan untuk memastikan ketelitian hasil pengujian ini, karena konsentrasi
β- glukan dari yeast telah ditentukan sebesar 56,5 yang tertera pada botol standar
yeast. Total Glukan –
α-glukan = β-glukan Pengukuran total glukan dilakukan dengan cara menghidrolisis ekstrak
sampel terlebih dahulu dengan menggunakan HCl pekat asam pekat kemudian sisa glukan yang tak terhidrolisis oleh HCl akan dihidrolisis oleh enzim exo-1,3-
glukanase hal ini bertujuan agar sampel yang merupakan polimer dapat
29
terhidrolisis secara sempurna menjadi monomer-monomernya yang berupa D- glukosa. Setelah terhidrolisis secara sempurna kemudian larutan diinkubasi
dengan GOPOD 4-aminoantipirin, asam p-hidroksi benzoat, enzim peroksidase sehingga warna larutan akan berubah menjadi warna merah yang dapat diukur
dengan spektrofotometer UV-Visibel pada panjang gelombang 510 nm. Dapat dilihat reaksi dari proses di atas adalah sebagai berikut Barry, 2009.
Reaksi 1
Reaksi 2
4 O
2
30
Pengukuran α-glukan dilakukan dengan cara menginkubasi sampel yang
telah dilarutkan dengan KOH 2N dengan enzim amyloglucosidase dan larutan invertase. Yang mana enzim tersebut hanya akan memotong-motong glukan pada
posisi α, sehingga hanya α-glukan yang terukur pada alat spektrofotometer.
Setelah penambahan enzim larutan ditambahkan enzim GOPOD 4- aminoantipirin, asam p-hidroksi benzoat, enzim peroksidase dan diinkubasi.
Akan terjadi perubahan warna menjadi warna merah sama halnya dengan pengukuran total glukan. Dapat dilihat reaksi dari proses di atas adalah sebagai
berikut Barry, 2009. Reaksi 1
α-glukan + H
2
O D-glukosa Reaksi yang selanjutnya terjadi pada pengukuran
α-glukan sama dengan pengukuran total glukan. Dari glukosa hingga pembentukan senyawa quinonimine
yang berwarna merah. 2. Congo Red
Gambar 13. Struktur molekul congo red
amyloglukosidase
31
Congo red adalah suatu garam natrium dari benzidinediazo-bis-1- naftilamin-4-asam sulfonat dengan rumus molekul C
32
H
22
N
6
Na
2
O
6
S
2
dan dengan berat molekul 696,66 gmol. Congo red larut dalam air, dan kelarutan congo red
paling baik dalam pelarut organik. Penggunaan congo red dalam bidang biokimia digunakan dalam penentuan kemurnian
β-glukan yang diisolasi dari gandum. Berawal dari penelitian tersebut, reagen congo red sampai sekarang masih dapat
digunakan sebagai penentuan kemurnian β-glukan Stensmaa, 2001.
Congo red pertama kali disintesis pada tahun 1883 oleh Paul Bottiger yang bekerja untuk perusahaan Friedrich Bayer di Elberfield, Jerman. Ia sedang
mencari pewarna tekstil yang tidak memerlukan langkah yang rumit. Perusahaan tersebut tidak tertarik dengan warna merah yang cerah. Jadi ia mengajukan paten
di bawah namanya kemudian dijual kepada perusahaan AGFA di Berlin. Pewarna tersebut membawa sukses besar untuk perusahaan AGFA, sehingga pada tahun-
tahun berikutnya dengan alasan yang sama perusahaan tersebut memasarkan pewarna lainnya dengan nama “congo”. Stensmaa, 2001
Metode congo red merupakan salah satu metode yang digunakan untuk menentukan adanya senyawa
β-glukan dari suatu bahan. Metode ini menggunakan reagen congo red sebagai pereaksi sehingga akan membentuk kompleks congo red
dan polisakarida yang berwarna merah. Senyawa congo red sendiri berwarna merah, tetapi apabila reagen ini tidak bereaksi terhadap suatu senyawa, maka
larutan akan berubah menjadi bening. Untuk uji pendahuluan dengan congo red tidak dikhususkan pada polisakarida tertentu tetapi polisakarida secara umum, jadi
untuk uji congo red hanya digunakan untuk mengetahui konsentrasi polisakarida
32
dari ekstrak sampel. Untuk mengetahui jenis senyawa yang terkandung dalam ekstrak sampel dapat dilakukan dengan cara kromatografi.
2.5. Spektrofotometri Infra Merah
