42
Residu jamur diekstraksi hingga empat kali dengan cara yang sama tetapi dengan volume yang berbeda untuk memastikan tidak ada senyawa pleuran
β-glukan yang terdapat dalam jamur tiram putihPleorotus ostreatus yang tersisa atau hanya tinggal sedikit sekali yang tertinggal pada residu jamur. Hasil yang
didapatkan dari hasil ekstraksi adalah berupa padatan glukan larut air.
3.3.2. Analisa Kualitatif Ekstrak Padatan Glukan Dengan FTIR
Sampel padatan glukan larut air sebanyak ± 20 mg dicampurkan dengan serbuk KBr, digerus pada lumping agate hingga tercampur rata dan diambil
sedikit kemudian masukan ke dalam cakram dan dipress dengan alat press holder. Setelah terbentuk film tipis, cakram KBr dimasukan pada KBr disc holder dan
spektrum sampel direkam pada range 400-4000 cm
-1
pada resolusi 8 dengan FTIR spektrofotometer. Hasilnya dibandingkan dengan spektrum standar barley 95.
3.3.3. Pengukuran Total Glucan dan D-Glukosa Megazyme
Sampel padatan glukan larut air dan yeast sebagai standar pengujian dimasukan ke dalam tabung glass uji tabung reaksi bertutup ukuran 20 x 125
mm sebanyak 100 mg, tabung digoyang-goyangkan hingga sampel jatuh seluruhnya ke bagian bawah tabung. Selanjutnya 1,5 mL asam klorida
terkonsentrasi 37 vv ditambahkan ke dalam tiap tabung 2 tabung, tutup tabung dan dikocok dengan vortex. Tabung ditempatkan dalam waterbath pada
suhu 30
o
C selama 45 menit dan vortex setiap 15 menit, kemudian ditambahkan 10 mL aquades pada tiap tabung, tutup tabung dan kocok dengan vortex. Selanjutnya
tutup tabung dilepaskan dan masukan tabung pada air mendidih ~100
o
C, setelah 5 menit tutup kembali dan inkubasi dilanjutkan selama 2 jam. Setelah 2 jam
43
dinginkan tabung pada suhu ruang, tutup tabung dilepaskan dengan hati-hati kemudian 10 mL KOH 2N ditambahkan pada tiap tabung. Bilas isi tabung
menggunakan buffer sodium asetat pH 5.0 ke dalam tabung bersih, tepatkan volumenya. Suspensi disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman GFA
atau sentrifus pada 1500 g selama 10 menit. Cairan yang jernih dipisahkan dari endapan yang telah disaring kemudian dimasukan ke dalam tabung glass uji
ukuran 16x100 mm. Reagen Exo-1,3-Glucanase 100 UmL plus β-Glucosidase
20UmL ditambahkan ke dalam sodium asetat buffer 200 mM, pH 5.0 pada tiap tabung, kocok tabung dengan menggunakan vortex dan inkubasi pada suhu
40
o
C selama 60 menit. Selanjutnya 3 mL reagen GOPOD ditambahkan pada tiap tabung dan inkubasi pada suhu 40
o
C selama 20 menit. Warna larutan berubah menjadi merah dan absorbansi semua larutan sampel, blanko, yeast dan standar
glukosa diukur pada panjang gelombang 510 nm. Setelah didapatkan absorbansi dari sampel, blanko, yeast dan standar
glukosa, dapat dihitung konsentrasi total glukan dengan cara manual lampiran 4 atau dengan menggunakan software Mega Calc lampiran 3 dengan memasukan
absorbansi tiap larutan.
3.3.4. Pengukuran α-Glukan Megazyme
Sampel padatan glukan larut air dan yeast sebagai standar pengujian yang terdapat dalam paket megazyme dimasukan ke dalam tabung glass uji bertutup
ukuran 20x125 mm, kemudian tutup tabung dan goyangkan hingga sampel jatuh seluruhnya ke dasar tabung. Magnetik stirer 5x15 mm dan 2 mL KOH 2N
dimasukkan ke dalam tiap tabung. Selanjutnya 8 mL buffer Sodium asetat 1,2
44
M, pH 3.8 dimasukan ke dalam tiap tabung, 0,2 mL Amyloglucosidase 1630 UmL plus larutan invertase 50 vv dalam gliserol ditambahkan perlahan-
lahan ke dalam tiap tabung, campur hingga rata dan tempatkan dalam waterbath pada suhu 40
o
C. Kemudian tabung diinkubasi pada suhu 40
o
C selama 30 menit dengan diselingi pengocokan oleh vortex. Untuk sampel dengan kandungan
α- glukan lebih dari 10 ; secara kuantitatif dipindahkan dengan menggunakan air
ke dalam volumetric flask, campur dengan baik kemudian larutan disentrifugasi pada 1500 g selama 10 menit. Untuk sampel dengan kandungan
α-glukan kurang dari 10 sentrifugasi semua larutan dalam tabung pada 1500g selama 10 menit.
Untuk semua sampel volume akhir dalam tabung 10 mL. Kemudian 0,1 mL aliquot dipindahkan ke dalam tabung glass uji 16x100 mm, selanjutnya sodium
asetat buffer 200 mM, pH 5.0 plus 3 mL reagen GOPOD Aminoantipirin, asam p-hidroksi benzoat dan enzim peroksidase ditambahkan ke dalam tabung uji dan
inkubasi pada suhu 40
o
C selama 20 menit. Absorbansi semua larutan sampel, blanko, yeast dan standar glukosa diukur pada panjang gelombang 510 nm.
Setelah didapatkan absorbansi dari sampel, blanko, yeast dan standar glukosa, dapat dihitung konsentrasi
α-glukan dengan cara manual lampiran 4 atau dengan menggunakan software Mega Calc lampiran 3 dengan memasukan
absorbansi tiap larutan.
3.3.5. Pengukuran Kadar β-glukan Metode Congo Red
