Pembuatan Pereaksi Metode pengambilan darah Analisis Data Ekstrak n-Heksana Ekstrak Etilasetat

dryer Modulyo, Edward, serial no; 3985, timbangan analitik, timbangan hewan, alat suntik, oral sonde, glukometer dan strip glukotes. 3.4.2 Bahan penelitian Bahan yang digunakan adalah Daun ubi jalar yang diperoleh dari daerah Pancur batu, streptozotocin Calbiochem, metformin Sigma, etanol 96 Merck, etil asetat Merck, n-heksana Merck, asam khlorida, kalium iodida, iodium , sublimat , asam sulfat,

3.5 Hewan uji

bismut subnitrat. Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisa. Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit putih jantan yang diperoleh dari Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner Regional I Medan, berat badan rata-rata 20-30 g, sehat. Hewan diaklimatisasi di laboratorium selama lebih kurang satu minggu. Hewan diberi makanan dan minuman yang sesuai. Hewan uji digunakan untuk uji pendahuluan dibagi 5 kelompok masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor yaitu: Kelompok I adalah kontrol negatip CMC 0,5, Kelompok II kontrol positip metformin 65 mgkg bb, Kelompok III En- HDUJ, Kelompok IV EEADUJ, Kelompok V EEDUJ dan untuk uji kerja induksi antidiabetes dibagi 8 kelompok masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor hewan uji yang sudah diinduksi yaitu: a Kelompok I adalah kelompok diberi CMC 0,5 sebagai kontrol negatip b Kelompok II adalah kontrol positif, yang diberi metformin. c kelompok uji III , IV, dosis 100 mgkg bb, V, VI, dosis 200 mgkg bb,VII dan VIII dosis 300 mgkg bb ekstrak daun ubi jalar.

3.6 Pembuatan Pereaksi

Universitas Sumatera Utara Pembuatan larutan pereaksi menurut Depkes RI 1995 asam klorida 2N, asam sulfat 2N, pereaksi Bouchardat, kloralhidrat, pereaksi Mayer, pereaksi Molish, natrium hidroksida 2N, timbal II asetat 0,4 M, asam sulfat 50 dalam metanol, besi III klorida 1, pereaksi Dragendorff, pereaksi Liebermann- Bouchardat. 3.7 Sampel 3.7.1 Pengambilan Bahan Pengambilan bahan dilakukan secara purposive, yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan serupa dari daerah lain. Bahan yang digunakan adalah daun ubi jalar diambil dari daerah Pancur Batu.

3.7.2 Identifikasi tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Medanense MEDA Universitas Sumatra Utara.

3.7.3 Pengolahan bahan

Daun ubi jalar segar dicuci sampai bersih, selanjutnya dipotong- potong dan diangin-anginkan sampai kering, kemudian diserbuk dan diayak sehingga diperoleh serbuk yang homogen. 3.7.4 Pembuatan ekstrak daun ubi jalar Pembuatan ekstrak daun ubi jalar dilakukan secara ekstraksi bertingkat yaitu maserasi dengan menggunakan beberapa pelarut seperti n-heksana, etilasetat dan etanol 96 Ditjen POM, 1972.

3.7.4.1 Ekstrak n-Heksana

Sebanyak 10 bagian serbuk kering daun ubi jalar dengan derajat halus B 40 dimasukkan ke dalam wadah maserasi dan dimaserasi dengan 75 bagian n- Universitas Sumatera Utara heksana, tutup, biarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil berulang- ulang diaduk, serkai, peras, cuci ampas dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Pindahkan ke dalam bejana bertutup, biarkan di tempat yang sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari. Enap tuangkan atau saring. Pelarut diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 40 o C hingga diperoleh ekstrak kental kemudian dikeringkan dengan Freeze dryer pada suhu ± - 40 o

3.7.4.2 Ekstrak etil asetat

C sehinggga diperoleh ekstrak n-heksana kering sebanyak 43 gram. Ampas dikeringkan dengan menganginkan Ditjen POM, 1972. Ampas yang sudah dikeringkan dimasukkan ke dalam wadah maserasi dan dimaserasi dengan 75 bagian etil asetat , tutup, biarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil berulang-ulang diaduk, serkai, peras, cuci ampas dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Pindahkan ke dalam bejana bertutup, biarkan di tempat yang sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari. Enap tuangkan atau saring. Pelarut diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 40 C hingga diperoleh ekstrak kental kemudian dikeringkan dengan Freeze dryer pada suhu ± - 40

3.7.4.3 Ekstrak Etanol

C sehinggga diperoleh ekstrak etilasetat kering sebanyak 49 gram. Ampas dikeringkan dengan menganginkan Ditjen POM, 1972. Ampas yang sudah dikeringkan dimasukkan ke dalam wadah maserasi dan dimaserasi dengan 75 bagian etanol 96, tutup, biarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil berulang-ulang diaduk, serkai, peras, cuci ampas dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Pindahkan ke dalam bejana tertutup, biarkan di tempat yang sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari. Enap Universitas Sumatera Utara tuangkan atau saring. Pelarut diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 40 C hingga diperoleh ekstrak kental kemudian dikeringkan dengan Freeze dryer pada suhu ± - 40

3.8 Karakterisasi Ekstrak n-Heksana, Etil asetat dan Etanol daun ubi jalar

C sehinggga diperoleh ekstrak Etanol kering sebanyak 123 gram Ditjen POM, 1972. Dilakukan pemeriksaan karakteristik dari ekstrak daun ubi jalar yaitu dengan cara sebagai berikut Ditjen POM, 1989.

3.8.1 Penetapan Kadar Air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat ini terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung penyambung dan tabung penerima 5 ml. Cara kerja: Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan kedalam labu alas bulat. Kemudian didestilasi selama 2 jam, setelah itu didinginkan selama 30 menit dan dibaca volume air dengan ketelitian 0,05 ml volume I. Ke dalam labu alas bulat tersebut kemudian dimasukkan 5 g ekstrak Daun ubi jalar yang telah ditimbang dengan seksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mulai mendidih, destilasi dengan kecepatan 2 tetes perdetik hingga sebagian besar air terdestilasi. Kemudian kecepatan destilasi dinaikkan hingga 4 tetes perdetik. Setelah semua air terdestilasi, bilas bagian dalam pendingin dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian labu penerima dibiarkan dingin sampai suhu kamar dan bersihkan tetesan air yang mungkin masih terdapat pada dinding tabung penerima. Setelah air dan toluen memisah sempurna, baca volume air volume II. Hitung kadar air dalam persen WHO, 1992.

3.8.2 Penetapan Kadar Abu Total

Universitas Sumatera Utara Sebanyak 2 g ekstrak daun ubi jalar yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan hingga arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 500 o

3.8.3 Penetapan Kadar Abu yang Tidak Larut Dalam Asam

C selama 2 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap berat ekstrak awal. Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap berat ekstrak awal.

3.8.4 Penetapan Kadar Sari yang Larut Dalam Air

Sebanyak 5,0 g ekstrak daun ubi jalar dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 1iter menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian didiamkan selama 18 jam. Disaring, uapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, panaskan residu pada suhu 105 °C hingga bobot tetap. Hitung kadar dalam persen senyawa yang larut dalam air, dihitung terhadap berat ekstrak awal.

3.8.5 Penetapan Kadar Sari yang Larut Dalam Etanol

Lakukan maserasi sejumlah 5,0 g ekstrak daun ubi jalar selama 24 jam dengan 100 ml etanol 95, menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring Universitas Sumatera Utara cepat dengan menghindarkan penguapan etanol, kemudian uapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, panaskan residu pada suhu 105 °C hingga bobot tetap. Hitung kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 95, dihitung terhadap berat ekstrak awal.

3.9 Penapisan Fitokimia Ekstrak Daun ubi jalar

Penapisan fitokimia ekstrak meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloida, flavonoida, glikosida antrakuinon, saponin, tannin dan steroidatriterpenoida Ditjen POM, 1989. 3.9.1 Pemeriksaan Alkaloida Ekstrak Daun ubi jalar ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit. Dinginkan dan saring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam. b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff, akan terbentuk warna merah atau jingga. c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning. d. Alkaloida positif jika ada terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan.

3.9.2 Pemeriksaan Flavonoid

Ekstrak Daun ubi jalar ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 10 ml metanol, refluk selama 10 menit dan disaring dalam keadaan panas. Filtrat diencerkan dengan air suling, setelah dingin ditambahkan eter minyak tanah, di Universitas Sumatera Utara kocok hati-hati lalu diamkan sebentar. Lapisan metanol diambil dan diuapkan pada temperatur 40 o a. Ambil 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol 96 ditambah 0,1 g serbuk Mg dan 10 tetes HCl p, jika terjadi warna merah jingga menunjukkan adanya flavonoid. C, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etil asetat , saring. Filtratnya digunakan untuk uji flavonoida, caranya: b. Ambil 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol 96 ditambah 0,5 g serbuk Zn dan 2 ml HCl 2 N, diamkan selama 1 menit, kemudian ditambah 10 tetes HCl p, jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoida.

3.9.3 Pemeriksaan Glikosida

Sebanyak 3 g ekstrak Daun ubi jalar ditambah 30 ml campuran alkohol 96 dengan air suling 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N, direfluks selama 1 jam, didinginkan dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3 dilakukan berulang sebanyak tiga kali Kumpulkan sari air diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50 o C. Sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol, masukkan kedalam tabung reaksi selanjutnya diuapkan di atas penangas air dan pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish selanjutnya ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat P melalui dinding tabung. Apabila terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan tanda adanya glikosida. Universitas Sumatera Utara

3.9.4 Pemeriksaan Glikosida Antrakinon

Sebanyak 0,2 g ekstrak daun ubi jalar ditambah 5 ml asam sulfat 2 N, di panaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzena, dikocok dan didiamkan, pisahkan lapisan benzena dan disaring. Filtrat berwarna kuning menunjukkan adanya antrakinon. Kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N, diamkan. Lapisan air berwarna merah intensif dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon.

3.9.5 Pemeriksaan Saponin

Sebanyak 0,5 g ekstrak daun ubi jalar dimasukkan kedalam tabung reaksi,ditambahkan 10 ml ml air panas, didinginkan kemudian dikocok selama 10 detik, jika terbentuk busa setinggi 10 cm yang stabil selama 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin.

3.9.6 Pemeriksaan Tanin

Sebanyak 0,5 g ekstrak daun ubi jalar disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1 bv. Jika terjadi warna biru atau kehitaman menunjukkan adanya tanin.

3.9.7 Pemeriksaan SteroidaTriterpenoida

Sebanyak 1 g ekstrak daun ubi jalar dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap, pada sisa tambahkan 10 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Liebermann Universitas Sumatera Utara Buchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru hijau menunjukkan adanya steroidatriterpenoida. 3.10 Penyiapan hewan percobaan Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit galur albino Swiss dengan berat badan 20-30 gram dibagi 8 kelompok, setiap kelompok terdiri dari 5 ekor. Hewan disesuaikan terlebih dahulu selama 1 minggu dengan lingkungannya. Makanan dan minuman selama pemeliharaan dan percobaan diberikan sama secara ad libitum. Hewan dipelihara dalam kandang yang memiliki ventilasi baik dan kebersihan selalu dijaga, bobot hewan ditimbang dan diamati perilakunya. Hewan-hewan yang dinilai sehat ditandai gerakan lincah kenaikan berat badan teratur digunakan dalam percobaan. 3.11 Pembuatan Sediaan Uji 3.11.1 Sediaan suspensi CMC 0,5 Timbang 500 mg CMC kemudian taburkan di atas air panas sebanyak 15 ml dalam lumpang, dibiarkan selma 15 menit hingga diperoleh massa yang transparan, setelah mengembang gerus kuat-kuat sampai terbentuk massa suspensi yang homogen, tambahkan air suling ad 100 ml hingga didapatkan konsentrasi suspensi CMC 0,5. 3.11.2 Pembuatan larutan pembanding Metformin Dosis metformin untuk manusia 500 mg per hari, maka dosis untuk mencit berat 20 g dikonfersikan = 0,0026 x 500 mg = 1,3 mg. Dosis per kg berat badan = 100020 x 1,3 mg = 65 mgkg bb.Timbang 65 mg Metformin masukkan dalam lumpang ditambahkan CMC 0,5 gerus sampai homogen kemudian cukupkan volumenya 10 ml ini disebut suspensi metformin SMet. Universitas Sumatera Utara

3.11.3 Pembuatan larutan Streptozotocin STZ

Sebanyak 55 mg STZ dilarutkan dengan 10 ml akuabides, kemudian disuntikkan pada mencit secara intraperitonial dengan dosis 55 mgkg bb. 3.11.4 Pembuatan suspensi EnHDUJ, EEADUJ dan EEDUJ. Masing- masing ekstrak dibuat suspensi dengan CMC 0,5 dengan dosis yang berbeda, dosis 100 mgkg bb, 200 mgkg bb dan 300 mgkg bb. Masing- masing dosis ditimbang dan dicampurkan dengan CMC 0,5 sampai homogen hingga volume 10 ml. Perhitungan dosis ekstrak seperti pada Lampiran 12 halaman 95. 3.12 Pengujian Farmakologi 3.12.1 Pengukuran kadar glukosa darah normal mencit Sebelum diberikan perlakuan, kadar glukosa darah mencit diukur terlebih dahulu, yaitu mencit dipuasakan selama 18 jam. Kemudian berat badan ditimbang dan kadar glukosa darah KGD puasa diukur dengan cara mengambil darah melalui vena bagian ekor dilukai. darah yang keluar disentuhkan pada Glukostrip yang sudah dipasangkan pada glukotes. Kemudian angka yang tampil pada layar dicatat sebagai kadar glukosa darah mgdl awal.

3.12.2 Uji pendahuluan

Uji pendahuluan dilakukan dengan metode tes toleransi glukosa oral TTGO yaitu pemberian glukosa 10 dengan dosis 1 gkg bb Vogel,2008. Mencit sehat yang sudah diaklimatisasi dipuasakan selama 18 jam kemudian ditimbang berat badan dan diukur kadar glukosa darahnya. Mencit dibagi lima Universitas Sumatera Utara kelompok masing–masing kelompok lima ekor. Kelompok 1 kontrol negatif diberi CMC 0,5, kelompok 2 kontrol positif SMet 65 mgkg bb, kelompok 3 Sn- HDUJ 200 mgkg bb, kelompok 4 SEEADUJ 200 mgkg bb dan kelompok 5 SEEDUJ 200 mgkg bb. Satu jam kemudian masing – masing kelompok diberi glukosa 10 dosis 1 gkg bb, pada menit ke 15, menit 30, 45, 60, 90 dan menit ke 120 diukur KGD mencit. Kemudian dari hasil KGD yang didapat dianalisis dan diambil dua ekstrak yang efek menurunkan KGD lebih besar digunakan untuk percobaan selanjutnya.

3.12.3 Penginduksian Diabetes hewan uji

Mencit yang akan diinduksi dipuasakan selama 18 jam air minum tetap diberikan, diinjeksi dengan larutan streptozotocin secara intraperitonial dengan dosis 55 mgkg bb. Sebelum diinduksi berat badan dan kadar glukosa darah mencit diukur dulu untuk mengetahui berat badan awal dan kadar glukosa darah awal. Hari ke-3 diukur kadar glukosa darah mencit, apabila ≥ 200 mgdl sudah dianggap diabetes.

3.12.3 Uji aktivitas antidiabetes SEEADUJ dan SEEDUJ

Dari hasil uji pendahuluan diambil dua ekstrak yang lebih besar khasiatnya dan masing-masing ekstrak dibuat 3 dosis yang berbeda, yaitu dosis 100 mgkg bb, 200 mgkg bb dan 300 mgkg bb. Hewan uji yang digunakan dalam percobaan ini mencit yang sudah diinduksi dibagi dalam 8 kelompok dan masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor, yaitu: a Kelompok I adalah kelompok mencit diberi CMC 0,5 sebagai kontrol negatip. Universitas Sumatera Utara b Kelompok II adalah kelompok mencit yang diberi SMet dosis 65 mgkg bb sebagai kontrol positip. c Kelompok III adalah kelompok uji ekstrak Etil asetat, kelompok yang diberi SEEADUJ dosis 100 mgkg bb. d Kelompok IV adalah kelompok uji ekstrak Etil asetat, kelompok yang diberi SEEADUJ dosis 200 mgkg bb e Kelompok V adalah kelompok uji ekstrak Etil asetat, kelompok yang diberi SEEADUJ dosis 300 mgkg bb. f Kelompok VI adalah kelompok uji ekstrak Etanol, kelompok yang diberi SEEDUJ dosis 100 mgkg bb. g Kelompok VII adalah kelompok uji ekstrak Etanol, kelompok yang diberi SEEDUJ dosis 200 mgkg bb. h Kelompok VIII adalah kelompok uji ekstrak Etanol, kelompok yang diberi SEEDUJ dosis 300 mgkg bb. Pemberian perlakuan dimulai setelah hewan uji positif diabetes, ini merupakan hari ke-1 perlakuan, setiap dua hari dilakukan pengukuran kadar glukosa darah. Pengujian kelompok hewan tersebut selama 2 minggu, pada hari ke 3, 5, 7, 9, 11, 13 dan 15.

3.13 Metode pengambilan darah

Darah mencit diambil dari ujung ekor, ekor dibersihkan dengan alkohol 70 kemudian disayat dengan pisau silet dan darah yang keluar ditempelkan pada kertas strip glukometer yang sudah terpasang pada alatnya kemudian angka yang keluar dilayar alat tersebut dicatat, bekas luka ujung ekor mencit diberi alkohol 70. Universitas Sumatera Utara

3.14 Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis variansi ANAVA, pada tingkat kepercayaan 95 dan untuk melihat perbedaan yang bermakna antar perlakuan digunakan uji rata-rata Duncan. Rancangan analisis data penelitian ditunjukan pada Tabel 3.1. Tabel 3.1 Rancangan Acak Lengkap

a. Ekstrak n-Heksana

Perlakuan t Ulangan r W0 W1 W2 W3 Wn Jumlah T Rataan Y SCMC0,5 SEnHDUJ SEnHDUJn 1 SMet R0 R1 R2 R3 Rn R0 R1 R2 R3 Rn R0 R1 R2 R3 Rn R0 R1 R2 R3 Rn ∑R ∑R Kontrol ∑R 1 ∑R n SCMC 0,5 Met SEnHDUJ SEnHDUJn 1 SMet Jumlah ∑W0 ∑W1 ∑W2 ∑W3 ∑Wn Tij Yij SCMC = Suspensi karboksi metil selulose SEnHDUJ = Suspensi Ekstrak n-Heksana Daun Ubi Jalar SMet = Suspensi Metformin

b. Ekstrak Etilasetat

Perlakuan t Ulangan r W0 W1 W2 W3 Wn Jumlah T Rataan Y SCMC0,5 SEEADUJ SEEADUJn 1 SMet R0 R1 R2 R3 Rn R0 R1 R2 R3 Rn R0 R1 R2 R3 Rn R0 R1 R2 R3 Rn ∑R ∑R Kontrol ∑R 1 ∑R n SCMC 0,5 Met SEEADUJ SEEADUJn 1 SMet Jumlah ∑W0 ∑W1 ∑W2 ∑W3 ∑Wn Tij Yij SEEADUJ = Suspensi Ekstrak Etilasetat Daun Ubi Jalar Universitas Sumatera Utara

c. Ekstrak Etanol