Perlakuan dan rancangan percobaan Inokulasi A. rhizogenes pada Bibit Manggis Pengamatan

5 Panjang akar primer Pengukuran panjang akar primer dilakukan pada akhir pengamatan. Akar primer dari pangkal batang sampai ujung akar diukur dengan menggunakan penggaris kemudian data yang diperoleh dikurangi dengan panjang akar sebelum diinokulasi. 6 Jumlah akar sekunder Perhitungan jumlah akar sekunder dilakukan pada akhir pengamatan dengan cara menghitung jumlah akar yang tumbuh dan melekat pada akar primer. 7 Jumlah akar tersier Perhitungan jumlah akar tersier dilakukan pada akhir pengamatan dengan cara menghitung jumlah akar yang tumbuh dan melekat pada akar sekunder. Percobaan B. Pengembangan Protokol Inokulasi A. rhizogenes yang Efektif untuk Menginduksi Perakaran Bibit Manggis Tujuan dari penelitian ini adalah untuk pengembangan protokol inokulasi A. rhizogenes yang efektif untuk peningkatan perakaran bibit tanaman manggis.

a. Perlakuan dan rancangan percobaan

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan dua faktor yang disusun secara faktorial, yaitu : Faktor I Konsentrasi Bakteri A. rhizogenes G = Kontrol tanpa A. rhizogenes G 1 = 509 OD 600 = 0.7 G 2 = 509 OD 600 = 1.0 G 3 = 07-20001 OD 600 = 0.7 G 4 = 07-20001 OD 600 = 1.0 G 5 = ATCC15834 OD 600 = 0.7 G 6 = ATCC15834 OD 600 = 1.0 G 7 = R-1000 OD 600 = 0.7 G 8 = R-1000 OD 600 = 1.0 G 9 = A4 OD 600 = 0.7 G 10 = A4 OD 600 = 1.0 Faktor II Umur Bibit Manggis T 1 = Bibit manggis umur 3 minggu T 2 = Bibit manggis umur 6 minggu T 3 = Bibit manggis umur 9 minggu Kombinasi perlakuan 11 x 3 = 33 dengan 8 ulangan sehingga terdapat 264 satuan percobaan. Data hasil pengamatan dianalisis dengan menggunakan sidik ragam uji F. Apabila dalam sidik ragam tersebut terdapat pengaruh perlakuan, analisis dilanjutkan dengan uji Duncan’s Multiple Range Test α=0.05.

d. Inokulasi A. rhizogenes pada Bibit Manggis

Bibit manggis umur 9, 6, dan 3 minggu telah disiapkan sebelumnya, dipilih yang seragam dan sehat. Ujung akar dipotong sepanjang 1 cm dengan pisau steril, lalu direndam dalam berbagai suspensi A. rhizogenes sesuai perlakuan konsentrasi A. rhizogenes dan di vakum selama 30 menit. Bibit dipindahkan ke kertas merang steril yang telah dibasahi dengan larutan hogland steril dan disimpan selama 2 hari pada suhu 28 o C, dalam kondisi gelap kemudian dipindahkan ke kotak pembibitan Gambar 7, pemeliharaan bibit dilakukan seperti percobaan B.

g. Pengamatan

Peubah-peubah yang diamati pada percobaan ini adalah ; 1. Pertambahan tinggi tanaman, diukur mulai dari permukaan tanah sampai titik tumbuh. 2. Jumlah daun, dihitung daun yang telah membuka sempurna, berwarna hijau atau masih merah. 3. Diameter batang, diukur pada ketinggian 1 cm di atas permukaan tanah. Peubah 1, 2, dan 3 diamati 1 bulan sekali dimulai sejak bibit berumur 1 bulan setelah inokulasi sampai umur 15 bulan. 4. Pengamatan perakaran dilakukan pengukuran panjang akar tampak yang dilakukan 1 bulan sekali dimulai sejak akar telah tampak pada bagian depan dan belakang wadah pembibitan sampai umur 15 bulan. Pada akhir penelitian, yaitu 15 Bulan Setelah Inokulasi BSI dilakukan pengamatan terhadap; 5. Bobot kering tajuk, 6. Panjang akar primer, jumlah akar sekunder, dan jumlah akar tersier, 7. Anatomi akar bibit manggis Anatomi akar bibit manggis hasil inokulasi beberapa strain A. rhizogenes dilakukan dengan menggunakan metode Nakamura 1995. Tahap 1 dilakukan dengan pengambilan akar tanaman manggis dan dipotong sepanjang 5 mm. Tahap 2, akar difiksasi selama 24 jam dalam larutan FAA 5 ml formaldehid, 5 ml asam asetat glasial dan 90 ml ethanol 70, kemudian dilanjutkan perlakuan Tahap 3–7, yaitu perlakuan dehidrasi dengan waktu perendaman untuk masing-masing tahap selama 1 jam. Potongan akar manggis direndam dalam larutan Tahap 3 40 ml n- Butanol, 30 ml etanol pekat dan 30 ml akuades; Tahap 4 55 ml n- Butanol, 25 ml etanol pekat dan 20 ml akuades; Tahap 5 70 ml n- Butanol, 20 ml etanol pekat dan 10 ml akuades; Tahap 6 85 ml n- Butanol dan 15 ml etanol pekat dan ; Tahap 7 100 ml n-Butanol. Tahap 7 diulang 2 kali setelah itu ditambahkan parafin cair ke dalam botol yang kemudian botol ditutup dan disimpan dalam suhu ruang selama 12 jam. Setelah perlakuan dehidrasi selesai dilanjutkan dengan perlakuan infiltrasi, yaitu dengan membuka tutup botol yang berisi spesimen akar manggis dan botol dimasukkan dalam oven parafin suhu 58 o C selama 1 hari. Kemudian parafin cair yang terdapat dalam botol dituang dan diganti dengan parafin cair baru. Botol selanjutnya dimasukkan ke dalam oven parafin suhu 56 o C selama 3 hari. Perlakuan Embedding. Tempat blok dioleskan dengan gliserin pekat secara merata, kemudian parafin cair dituangkan ke dalam tempat blok dan spesimen berupa akar manggis diatur posisinya dimana posisi spesimen tidak sampai tenggelam harus berada di tengah parafin. Setelah diatur posisinya, permukaan spesimen ditiup agar sedikit mengeras. Tempat blok berisi parafin dan spesimen akar manggis diletakkan di telapak tangan dan dicelup ke dalam air, dibiarkan selama 3 menit, setelah itu permukaan disiram perlahan dengan air dan biarkan tenggelam dalam wadah berisi air. Parafin dan spesimen akar manggis dengan sendirinya akan lepas dari tempat blok kemudian diambil dan dikeringkan dengan tisu diberi label dan selanjutnya direndam selama 1 bulan dalam larutan Gifford 20 ml asam asetat glasial, 80 ml etanol 60 dan 5 ml gliserin. Membuat Sayatan. Sebelum disayat spesimen akar manggis terlebih dahulu ditempelkan pada holder, dengan cara ; holder bagian atasnya dilapisi dengan paraplast menggunakan spatula yang dipanaskan, kemudian spesimen akar manggis dengan cepat dilekatkan pada holder. Setelah itu spesimen dibentuk prisma dengan cara memanaskan spatula. Spesimen didiamkan selama 24 jam. Spesimen yang telah dilekatkan pada holder disayat dengan mikrotom putar setebal 10 µm. Sayatan direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi dengan albumin-gliserin 1 : 1 dan ditetesi air. Gelas obyek berisi pita parafin dipanaskan pada hot plate dengan suhu 45 o C selama 3-5 jam. Perlakuan Pewarnaan. Dilakukan pewarnaan ganda safranin 2 dalam air dan fastgreen 0.5 dalam etanol 95. Berturut turut gelas obyek direndam ke dalam larutan berikut : Xilol I 5 menit, xilol II 5 menit, etanol absolut 3 menit, etanol 95 3 menit, etanol 70 3 menit, etanol 50 3 menit, etanol 30 3 menit, akuades 3 menit, safranin 2 3 hari, akuades 3 menit, etanol 30 5 menit, etanol 50 5 menit, etanol 70 5 menit, etanol 95 5 menit, fast green 0.5 2 menit, Etanol I 5 menit Etanol II 5 menit, xilol I 5 menit dan xilol II 5 menit. Selanjutnya dilakukan penutupan, dimana bahan diberi media canada balsam dan ditutup dengan gelas penutup. Kemudian pada sisi kiri gelas obyek diberi label. Pengamatan dilakukan terhadap : rata-rata diameter pembuluh xilem µm, jumlah total pembuluh xilem pada sayatan melintang, luas serapan permukaan sayatan melintang [rata-rata diameter xilem 2] 2 x π x jumlah total pembuluh xilem pada sayatan melintang, total luasan sayatan melintang π r 2 , dan rasio luas serapan permukaan sayatan melintang total luasan sayatan melintang Leuschner Hertel 2003 Lampiran 1. 8. Pengamatan rambut akar bibit manggis Pengamatan rambut akar dari akar sekunder bibit manggis dilakukan berdasarkan pengamatan mikroskopik menggunakan mikroskop inverted dan Scanning Electron Microscop SEM. Pengamatan rambut akar secara mikroskopik, dilakukan dengan pengamatan langsung sampel akar dibawah mikroskop inverted. Pengamatan rambut akar dengan Scanning Electron Microscop SEM dilakukan dengan cara : sampel berupa akar sekunder yang berukuran 0.5 cm dicuci di dalam larutan bufer sodium cacodilat selama 2 jam pada suhu 4 o C, kemudian akar dicuci ulang dengan larutan bufer sodium cacodilat pada alat getar ultrasonic sonycation selama 5 menit pada suhu kamar. Selanjutnya sampel difiksasi dengan glutaral dehid 2.5 selama 2 jam pada suhu 4 o C. Kemudian direndam dalam 2 tannic acid pada suhu 4 o C selama 2 hari. Selanjutnya cuci dengan larutan bufer sodium cacodilat sebanyak 4 kali masing-masing tahap berlansung 15 menit suhu 4 o C. Kemudian cuci dengan akuades pada suhu 4 o C sebanyak 2 kali. Proses dehidrasi dilakukan dengan seri etanol, yaitu pertama-tama sampel direndam dalam alkohol 50 selama 5 menit suhu 4 o C sebanyak 4 kali, alkohol 75 selama 20 menit suhu 4 o C, alkohol 80 selama 20 menit suhu 4 o C, alkohol 94 selama 20 menit suhu ruang dan dalam etanol absolut 10 menit suhu ruang sebanyak 2 kali. Selanjutnya rendam sampel dalam t-Butanol selama 10 menit pada suhu ruang, freezer drying -20 o C sampai t-Butanol hilang. Kemudian sampel akar diletakkan pada speciment holder untuk dilapisi dengan logam emas dan siap untuk diamati dengan SEM Lampiran 2. 9. Uji konfirmasi T-DNA melalui teknik Polymerase Chain Reaction PCR Konfirmasi adanya integrasi T-DNA, yaitu daerah TL dan TR- DNA dari A. rhizogenes terhadap sel tanaman manggis dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction PCR. Sebagai kontrol positif digunakan DNA plasmid A. rhizogenes dan sebagai kontrol negatif digunakan DNA akar bibit manggis yang tidak diinokulasi, sedangkan DNA uji adalah DNA dari akar bibit manggis yang diinokulasikan dengan A. rhizogenes. Isolasi DNA Plasmid A. rhizogenes. Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan menggunakan modifikasi metode Sambrook et al. 1989 yang dimodifikasi. Strain A. rhizogenes dikulturkan pada media YMB dan LB cair, diletakkan pada mesin pengocok dengan kecepatan 100 rpm selama 24 jam. Kultur dituang ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml dan disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit sehingga membentuk pelet. Pelet yang terbentuk dilarutkan dengan bufer TELT 50 mM Tris-Cl pH 7.5, 82 mM EDTA, 2.5 M LiCl, 0.4 Triton X- 100, kemudian ditambah 50 µl lisozim 10 mgml lalu dihomogenkan dan diinkubasi pada 37 o C selama 1 jam. Setelah itu ditempatkan pada air mendidih selama 1-2 menit dan dimasukkan ke dalam air es beberapa saat. Selanjutnya ditambahkan 50 µl SDS 10 dan dibolak-balik sampai terjadi lisis dan terlihat berlendir. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dipindahkan pada tabung baru dan ditambahkan 2-3 volume etanol absolut dingin. Untuk memurnikan DNA ditambahkan 0.1 volume Na asetat 3 M dan disimpan pada suhu -20 o C selama 30 menit. Selanjutnya campuran disentrifus kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit sehingga membentuk pelet DNA. Pelet DNA dicuci dengan alkohol 70 lalu dikeringkan dengan vakum dan dilarutkan dengan akuabides steril, dan selanjutnya dapat digunakan untuk uji PCR. Isolasi DNA Akar Bibit Manggis. Isolasi dilakukan dengan menggunakan metode CTAB yang dimodifikasi Castillo et al. 1994. Akar manggis sebanyak 0.5 g dimasukkan ke dalam mortar, lalu ditambahkan nitrogen cair dan PVPP, kemudian digerus sampai halus. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah berisi 1 ml bufer CTAB 2 dan 5 µl merkaptoetanol. Campuran diinkubasikan pada suhu 60 o C selama 30 menit dan dibiarkan mencapai suhu ruang. Selanjutnya untuk memurnikan DNA ditambahkan 700 µl kloroform : isoamilalkohol 24:1 dan dikocok, disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru dan diekstraksi kembali dengan penambahan 1 ml kloroform : isoamilalkohol 24 :1 dan dikocok, selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindah ke tabung baru dan ditambahkan 1 ml isopropanol dingin lalu dibolak-balik perlahan sampai homogen dan disimpan pada suhu 4 o C selama 30 menit, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Cairan dibuang dan endapan dilarutkan dengan menambahkan 250 µl bufer TE lalu dihomogenkan, dan untuk menghilangkan RNA, ditambahkan 25 µl RNAse kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 jam. Selanjutnya ditambahkan 25 µl natrium asetat 3 M pH 5,2 dan 500 µl etanol absolut dingin, dikocok hingga homogen. Selanjutnya disimpan dalam freezer selama 30 menit, kemudian disentrifus kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Endapan dicuci dengan etanol 70, keringkan dan dilarutkan dengan bufer TE pH 8. DNA siap digunakan untuk uji PCR. Analisis DNA dengan PCR. Hasil isolasi DNA plasmid A. rhizogenes dan DNA akar bibit manggis dianalisis dengan PCR menggunakan metode Aoki et al. 1997 yang dimodifikasi. Pereaksi PCR berupa bufer TrisHCl 1 mM + dNTP 0.2 mM mix yang telah berisi MgCl 2 200 µM + primer TL 10 pmol + enzim Taq DNA Polymerase 1 unit. Volume reaksi untuk PCR adalah 25 µl dengan penambahan 50 ng DNA dan H 2 O. Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan Thermolyne Amplitron I dengan kondisi denaturasi 94 o C selama 1 menit, annealing 55 o C selama 1 menit dan polimerasi 72 o C selama 2 menit sampai 35 siklus reaksi. Hasil PCR difraksinasi melalui gel elektroforesis dengan konsentrasi 0.8 agaros dengan penambahan loading dye bromphenolblue sebagai pemberat. Elektroforesis dilakukan dengan arus 36 mA, 100 volt selama 60 menit. Sebagai marker digunakan DNA 1 kb lader. Hasil elektroforesis dilihat dengan menggunakan UV laminar dan didokumentasi dengan menggunakan kamera Lampiran 3. Primer TL berupa rol B1 sekuen 5’ ATGGATCCCAAATTG CTATTCCCCCACG 3’ dan rol B2 sekuen 5’ TTAGGCTTCTTTCATTCG GGTTTACTGCAGC 3’ Hamill et al. 1991 . 10. Serapan hara N, P, dan K daun bibit manggis Penetapan kandungan nitrogen dengan metode Semi-mikro Kjeldahl dan penetapan kandungan P dan K daun dengan metode pengabuan kering Lampiran 4. 11. Kandungan hormon IAA akar bibit manggis Pengukuran kandungan hormon akar bibit manggis dilakukan dengan metode Ergűn et al. 2002, sebanyak 1 g akar segar bibit manggis yang telah dihaluskan, dimasukkan dalam 60 ml larutan ekstrak MeOH: CHCl 3 : 2N NH 4 OH, 12:5:3 vvv. Larutan ekstrak tersebut dibuat satu hari sebelum dipergunakan dan disimpan pada - 20 o C. Campuran akar dan larutan ekstrak tersebut diaduk selama 1 jam kemudian disaring dengan kertas saring sampai didapatkan cairan yang bersih. Cairan tersebut ditambahkan 25 ml akuades diaduk dan biarkan sampai terbentuk dua fase, fase kloroform dibuang sedangkan fase air di atur pH-nya menjadi 2.5 kemudian diekstrak 3 kali dengan 15 ml etil asetat. Fase air dan etil asetat dipisahkan. Fase etil asetat selanjutnya dipergunakan untuk pengukuran IAA bebas sedangkan fase air di pH kembali sampai menjadi pH 11 yang selanjutnya diinkubasikan pada suhu 70 o C selama 1 jam dan dibiarkan mencapai suhu ruang.. Prosedur yang sama dilakukan untuk mengisolasi IAA dalam bentuk terikat. Etil asetat dievaporasi menggunakan alat rote-evaporator system Büchi Instruments. Thin-layer chromatography TLC dikerjakan menggunakan silika gel GF254 Merck sebanyak 30 g dilarutkan dalam 75 ml akuades kemudian dituangkan di atas glass plaque dan disimpan dalam inkubator selama 2.5 jam, kemudian 10 µl IAA bebas, terikat dan standar ditetes di atas glass plaque tersebut selanjutnya diletakkan dalam tabung kaca yang telah berisi larutan eluen TLC i- PrOH:NH 4 OH:H 2 O 10:1:1 vvv selama 3 jam setelah itu dilarutkan dengan 2 ml metanol kemudian disaring dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 222 nm Lampiran 5. HASIL PENELITIAN Percobaan A. Seleksi Strain Agrobacterium rhizogenes Spesifik Penginduksi Perakaran Bibit Manggis Garcinia mangostana L. Perkembangan akar bibit manggis diamati pada 24 minggu setelah inokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes adalah panjang akar primer, jumlah akar sekunder dan jumlah akar tersier. Faktor berbagai strain A. rhizogenes dan metode inokulasi berpengaruh sangat nyata terhadap panjang akar primer dan jumlah akar sekunder bibit manggis umur 24 minggu setelah inokulasi MSI sedangkan interaksi antara berbagai strain A. rhizogenes dan metode inokulasi tidak berpengaruh nyata. Tabel 1 menunjukkan bahwa inokulasi strain ATCC-15834, 07-20001, A4, 509, dan R1000 pada akar bibit manggis menghasilkan panjang akar primer dan jumlah akar sekunder yang nyata lebih besar dibandingkan dengan bibit yang tidak di inokulasi kontrol. Bibit yang diinokulasi dengan metode akar dipotong menghasilkan panjang akar primer dan jumlah akar sekunder yang tertinggi dibandingkan metode akar ditusuk. Tabel 1. Panjang akar primer cm dan jumlah akar sekunder buah bibit manggis umur 24 MSI. Strain A.rhizogenes Panjang akar primer cm Jumlah akar sekunder buah Kontrol 07-20001 R1000 A4 509 ATCC-15834 MAFF 01-1724 ATCC-8196 510 511 A4-J 6.03 c 11.65 a 9.42 ab 9.87 ab 10.22 ab 10.32 ab 5.72 c 6.52 c 5.73 c 6.18 c 7.55 bc 7.17 bc 11.50 a 8.33 ab 10.50 a 12.33 a 13.17 a 2.50 d 4.50 bcd 2.17 d 3.17 cd 5.17 bcd Metode inokulasi A. rhizogenes Akar ditusuk Akar dipotong 6.51 b 9.71 a 4.82 b 9.82 a Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT α = 0.05. Faktor strain A. rhizogenes, metode inokulasi dan interaksi antara strain A. rhizogenes dengan metode inokulasi berpengaruh sangat nyata terhadap jumlah akar tersier bibit tanaman manggis umur 24 MSI. Inokulasi strain A4, 07-20001, ATCC-15834, dan 509 menghasilkan jumlah akar tersier yang nyata lebih banyak pada metode inokulasi akar dipotong dibandingkan dengan metode akar ditusuk Tabel 2. Performansi akar bibit manggis setelah diinokulasikan dengan berbagai strain A. rhizogenes dapat dilihat pada Gambar 8. Pertumbuhan akar primer lebih panjang, jumlah akar sekunder dan tersier lebih banyak setelah diinokulasikan dengan strain A4, 07-20001, ATCC-15834, dan 509. Selanjutnya bibit yang diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes juga dapat meningkatkan pertumbuhan tajuk bibit manggis. Perkembangan akar bibit manggis yang lebih baik setelah diinokulasi dengan strain ATCC15834, 07-20001, A4 dan 509 pada metode akar dipotong ternyata menghasilkan pertambahan diameter batang yang nyata lebih tinggi dibanding kontrol Tabel 2. Tabel 2. Jumlah akar tersier buah dan diameter batang mm bibit manggis umur 24 MSI Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT α = 0.05. Jumlah akar tersier buah Pertambahan diameter batang mm Metode inokulasi Metode inokulasi Strain A. rhizogenes Akar ditusuk Akar dipotong Akar ditusuk Akar dipotong Kontrol 07-20001 R1000 A4 509 ATCC-15834 MAFF 01-1724 ATCC-8196 510 511 A4-J 11.00 cd 2.00 cd 6.00 cd 14.33 cd 18.33 c 6.00 cd 4.67 cd 1.67 cd 2.33 cd 3.33 cd 4.00 cd 9.33 cd 91.67 a 38.00 b 93.00 a 76.33 a 79.00 a 5.67 cd 9.33 cd 1.33 d 2.67 cd 6.00 cd 0.480 bcde 0.357 ef 0.407 def 0.383 ef 0.433 def 0.427 def 0.343 ef 0.343 ef 0.347 ef 0.360 ef 0.327 f 0.350 ef 0.600 ab 0.543 bcd 0.600 ab 0.577 abc 0.693 a 0.533 bcd 0.453 bcd 0.357 cdef 0.330 f 0.367 ef Gambar 8. Performansi akar bibit manggis umur 24 minggu setelah diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes 2.5 cm R1000 2.5 cm 07-20001 ATCC15834 2.5 cm 2.5 cm Kontrol 2.5 cm 509 2.5 cm A4 2.5 cm MAFF 01-1724 2.5 cm ATCC 8196 510 2.5 cm 511 2.5 cm 2.5 cm A4 J 2.5 cm R1000 2.5 cm 07-20001 ATCC15834 2.5 cm 2.5 cm Kontrol 2.5 cm 509 2.5 cm A4 2.5 cm MAFF 01-1724 2.5 cm ATCC 8196 510 2.5 cm 511 2.5 cm 2.5 cm A4 J Faktor berbagai strain A. rhizogenes dan metode inokulasi berpengaruh sangat nyata terhadap pertambahan jumlah daun bibit tanaman manggis umur 24 MSI, sedangkan interaksi keduanya tidak berpengaruh nyata. Bibit yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834, 07-20001 dan A4 menghasilkan pertambahan jumlah daun yang nyata lebih banyak dibandingkan dengan kontrol. Metode inokulasi akar dipotong menghasilkan pertambahan jumlah daun yang nyata lebih besar dibandingkan dengan akar ditusuk Tabel 3. Performansi bibit manggis hasil inokulasi berbagai strain A. rhizogenes dengan metode akar dipotong umur 24 minggu setelah inokulasi dapat dilihat pada Gambar 9. Bibit manggis yang diinokulasi A. rhizogenes memperlihatkan performansi lebih baik dibandingkan dengan bibit yang tidak diinokulasi. Tabel 3. Pertambahan jumlah daun helai dan tinggi cm bibit manggis umur 24 MSI. strain A. rhizogenes Pertambahan jumlah daun helai Pertambahan tinggi cm Kontrol 07-20001 R1000 A4 509 ATCC-15834 MAFF 01-1724 ATCC-8196 510 511 A4-J 5.67 dc 8.67 ab 7.00 bcd 8.00 abc 7.33 bcd 9.67 a 7.00 bcd 5.67 dc 5.67 dc 5.67 dc 5.33 dc 4.60 d 7.18 ab 6.67 bc 7.20 ab 7.42 ab 8.17 a 4.87 d 6.52 bc 4.98 d 4.57 d 5.75 cd Metode inokulasi A. rhizogenes Akar ditusuk Akar dipotong 6.12 b 7. 64 a 5.66 b 6.68 a Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT α = 0.05. Berdasarkan Tabel 3 juga terlihat bahwa faktor berbagai strain A. rhizogenes dan metode inokulasi berpengaruh sangat nyata terhadap pertambahan tinggi bibit tanaman manggis umur 24 MSI, sedangkan interaksi keduanya tidak berpengaruh nyata. Metode inokulasi akar dipotong menghasilkan pertambahan tinggi bibit yang nyata lebih besar dibandingkan dengan metode akar ditusuk. Inokulasi strain ATCC-15834, 07-20001, A4 dan 509 menghasilkan pertambahan tinggi yang nyata lebih besar dibanding kontrol. Gambar 9. Performansi bibit manggis umur 24 minggu setelah dinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes dengan metode akar dipotong Metode inokulasi strain A. rhizogenes pada akar bibit manggis juga berpengaruh terhadap persentase hidup bibit tanaman manggis. Metode inokulasi dengan cara akar dipotong menghasilkan persentase bibit manggis yang hidup lebih tinggi dibandingkan metode inokulasi dengan cara akar ditusuk setelah 6 bulan diinokulasi Gambar 10. Gambar 11 menunjukkan bahwa inokulasi dengan A. rhizogenes strain ATCC 15834, 509, 07-20001, A4, dan kontrol memperlihatkan 100 bibit tanaman manggis dapat tumbuh dengan baik sampai umur 6 bulan setelah inokulasi. Jadi secara umum dapat dikatakan bahwa inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834, 07-20001, A4 dan 509 merupakan strain-strain A. Kontrol ATCC 15834 509 07-20001 R1000 A4 rhizogenes yang lebih efektif dalam menginokulasi akar bibit manggis pada metode akar dipotong dibandingkan inokulasi dengan strain ATCC-8196, MAFF 01-1724, 511, 510 dan R1000. 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 Umur Bulan T a n a m a n H id u p Akar Dipotong Akar Ditusuk Gambar 10. Persentase tanaman yang hidup pada perlakuan metode inokulasi akar ditusuk dan dipotong umur 6 bulan setelah inokulasi 20 40 60 80 100 K o n tr o l 7 2 1 R 1 A 4 5 9 A T C C -1 5 8 3 4 M A F F 1 -1 7 2 4 A T C C - 8 1 9 6 5 1 5 1 1 A 4 -J Strain A. rhizogenes T a n a m a n H id u p Akar dipotong Akar ditusuk Gambar 11. Persentase tanaman hidup setelah diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes umur 6 bulan setelah inokulasi Berdasarkan hasil percobaan ini didapatkan A. rhizogenes strain ATCC-15834, 07-20001, A4 dan 509 yang spesifik penginduksi perakaran bibit manggis dengan metode akar dipotong. Untuk meningkatkan keefektivan dari strain tersebut dilakukan percobaan B dengan jumlah tanaman yang lebih banyak dan pengamatan yang lebih teliti. Percobaan B. Pengembangan Protokol Inokulasi A. rhizogenes yang Efektif untuk Menginduksi Perakaran Bibit Manggis Perkembangan Akar Bibit Manggis Inokulasi strain A. rhizogenes pada konsentrasi OD 600 = 0.7 dan 1.0 pada berbagai umur bibit manggis berpengaruh terhadap perakaran manggis. Pada Tabel 4 terlihat bahwa umur bibit manggis saat diinokulasi nyata mempengaruhi panjang akar primer, jumlah akar lateral dan panjang akar tampak sedangkan konsentrasi strain A. rhizogenes dan interaksinya tidak berpengaruh nyata terhadap panjang akar primer, jumlah akar sekunder dan panjang akar tampak bibit manggis umur 15 Bulan Setelah Inokulasi BSI. Tabel 4. Panjang akar primer cm, jumlah akar sekunder buah dan panjang akar tampak cm bibit manggis umur 15 BSI Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT α = 0.05. Panjang akar primer terbesar dihasilkan bibit manggis yang diinokulasi pada umur 9 minggu 15.01 cm dan tidak berbeda nyata dengan bibit yang diinokulasi umur 6 minggu 13.72 cm, sedangkan inokulasi pada umur 3 minggu menghasilkan panjang akar primer terkecil 11.53 cm. Untuk jumlah akar sekunder terbesar 22.64 buah dan panjang akar tampak terbesar 11.57 cm dihasilkan pada bibit yang diinokulasi umur 6 minggu. Berdasarkan Tabel 5 terlihat bahwa interaksi konsentrasi strain A. rhizogenes dengan umur bibit berpengaruh nyata terhadap jumlah akar tersier. Bibit manggis yang diinokulasi dengan strain ATCC15834 pada umur 3 dan 6 minggu konsentrasi OD 600 =1.0 menghasilkan jumlah akar tersier yang terbesar. Inokulasi pada umur 9 minggu konsentrasi OD 600 =1.0 dengan strain 509 menghasilkan jumlah akar tersier yang terbesar. Sedangkan strain ATCC-15834 Perlakuan umur bibit manggis minggu Panjang akar primer cm Jumlah akar sekunder buah Panjang akar tampak cm 3 11.53 b 13.66 c 3.42 b 6 13.72 a 22.64 a 11.57 a 9 15.01 a 17.39 b 3.63 b yang diinokulasikan pada bibit manggis umur 3 minggu konsentrasi OD 600 =0.7 menghasilkan jumlah akar tersier yang paling kecil. Tabel 5. Jumlah akar tersier buah bibit manggis umur 15 BSI Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf kecil yang sama pada baris yang sama, dan angka yang diikuti huruf besar yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT α = 0.05 Selanjutnya Tabel 6 menunjukkan bahwa inokulasi strain ATCC-15834 dan 07-20001 konsentrasi OD 600 =1.0 pada bibit manggis umur 3 minggu menghasilkan jumlah akar kuarter terbesar, untuk bibit yang diinokulasi umur 9 minggu jumlah akar kuarter terbesar terdapat pada bibit yang diinokulasi dengan strain A4 konsentrasi OD 600 =1.0. Dari berbagai umur inokulasi tersebut dan konsentrasi A. rhizogenes yang digunakan, ternyata inokulasi bibit manggis dengan strain ATCC-15834 konsentrasi OD 600 =1.0 pada umur 6 minggu memperlihatkan perkembangan akar yang lebih besar dibandingkan dengan inokulasi pada umur 3 dan 9 minggu. Sementara hasil inokulasi strain A4 konsentrasi OD 600 =1.0 pada bibit manggis umur 3 minggu menghasilkan jumlah akar kuarter yang lebih kecil dibandingkan kontrol. Jumlah akar tersier buah Umur bibit manggis saat inokulasi Konsentrasi strain A. rhizogenes OD 600 3 minggu 6 minggu 9 minggu Kontrol 12.67 cE 31.50 bG 51.33 aC R1000 0.7 12.00 cE 60.33 aE 32.33 bF R1000 1.0 19.33 cD 127.33 aC 53.33 bC A4 0.7 35.50 aB 35.33 aF 35.33 aF A4 1.0 11.67 cE 67.00 bD 76.00 aB 509 0.7 25.67 bC 20.67 cH 44.33 aD 509 1.0 27.00 bC 28.67 bG 93.33 aA 07-20001 0.7 37.00 bB 18.00 cH 41.00 aE 07-20001 1.0 36.33 bB 163.00 aB 34.00 bF ATCC-15834 0.7 7.33 cF 69.00 aD 25.00 bG ATCC-15834 1.0 103.33 bA 189.00 aA 21.67 cH Tabel 6. Jumlah akar kuarter buah bibit manggis umur 15 BSI Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf kecil yang sama pada baris yang sama, dan angka yang diikuti huruf besar yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT α = 0.05 Anatomi Akar Bibit Manggis Berdasarkan hasil analisis di atas, didapat strain A.rhizogenes yang paling efektif menginfeksi akar bibit manggis adalah ATCC 15834 konsentrasi OD 600 =1.0 yang diinokulasikan pada bibit manggis umur 6 minggu. Untuk melihat lebih jauh keefektivan dari strain-strain A. rhizogenes konsentrasi OD 600 =1.0 yang diinokulasikan pada akar bibit manggis umur 6 minggu dalam peningkatan perakaran bibit manggis, maka dilakukan pengamatan anatomi akar bibit manggis. Dari hasil sayatan melintang akar bibit manggis terlihat bahwa akar manggis yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834 menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem 7.167µm, luas serapan permukaan sayatan melintang 3266.9 µm 2 , dan total luasan pembuluh xilem 1344.97µm 2 yang nyata lebih besar dibandingkan kontrol Tabel 7. Sayatan melintang akar bibit manggis umur 15 bulan setelah inokulasi dengan strain A.rhizogenes dapat dilihat pada Gambar 12. Sayatan melintang akar bibit manggis yang diinokulasi dengan A.rhizogenes strain ATCC-15834 konsentrasi OD 600 =1.0 pada umur 6 Jumlah akar kuarter buah Umur bibit manggis saat inokulasi Konsentrasi strain A.rhizogenes OD 600 3 minggu 6 minggu 9 minggu Kontrol 1.17 bB 4.00 aF 1.50 bB R1000 0.7 2.33 cB 11.00 aD 5.00 bB R1000 1.0 1.33 cB 27.00 aC 3.00 bB A4 0.7 1.17 cB 9.00 aE 3.67 bB A4 1.0 0.00 cB 5.33 bF 16.00 aA 509 0.7 3.33 aB 3.67 aF 3.67 aB 509 1.0 1.33 cB 7.67 aE 4.67 bB 07-20001 0.7 4.67 aB 5.67 aF 1.33 bB 07-20001 1.0 6.33 bA 33.00 aB 3.33 bB ATCC-15834 0.7 0.67 cB 7.33 aE 5.00 bB ATCC-15834 1.0 6.00 bA 40.33 aA 2.33 cB minggu memperlihatkan perkembangan xilem yang lebih baik dibandingkan dengan kontrol. Tabel 7. Anatomi akar bibit manggis umur 15 BSI strain A. rhizogenes Rata-rata diameter pembuluh xilem µm Luas serapan permukaan sayatan melintang µm 2 Total luasan pembuluh xilem µm 2 Kontrol 3.80 d 301.9 d 445.88 c R1000 5.02 c 675.9 c 511.82 c A4 5.09 c 963.5 bc 833.15 b 509 3.53 d 304.3 d 495.07 c 07-20001 5.93 b 1159.4 b 577.76 c ATCC-15834 7.17 a 3266.9 a 1344.97 a Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT α = 0.05 Inokulasi A. rhizogenes ternyata mampu merangsang terbentuknya rambut akar yang berkembang lebih baik pada akar sekunder bibit manggis. Berdasarkan hasil pengamatan dengan mikroskop inverted, inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 umur 6 minggu pada konsentrasi OD 600 =1.0 memperlihatkan perkembangan rambut akar yang lebih baik dibandingkan inokulasi dengan strain 07-20001, 509, A4 dan R1000, pada akar bibit manggis yang tidak diinokulasi kontrol tidak ditemukan adanya pertumbuhan rambut akar. Rambut akar dari akar sekunder bibit tanaman manggis umur 15 bulan setelah inokulasi dapat dilihat pada Gambar 13. Rambut akar tersebut sangat halus, dinding selnya tipis, dan transparan. Pengamatan rambut akar lebih lanjut dengan Scanning Electron Microscop SEM pada akar sekunder bibit manggis, juga memperlihatkan keadaan yang sama dimana pertumbuhan rambut akar dapat berkembang lebih baik setelah diinokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 umur 6 minggu pada konsentrasi OD 600 =1.0. Rambut akar tersebut sangat halus, ukuran panjang rambut akar 50 μm, dan berbentuk tabung memanjang silinder. Hasil Scanning Electron Microscop rambut akar dari akar sekunder bibit manggis umur 15 bulan setelah inokulasi dengan A. rhizogenes dapat dilihat pada Gambar 14. Rambut akar yang muncul merupakan pemanjangan sel epidermis dalam bidang yang tegak lurus permukaan akar. Gambar 12. Sayatan melintang akar bibit manggis umur 15 bulan setelah diinokulasi dengan strain A.rhizogenes, dimana A= jaringan pembuluh, B= floem, C= xilem, dan D= endodermis. A B C D 20 µm Kontrol A B C D 20 µm R1000 A B C D 20 µm A4 A B C D 20 µm 509 A B C D 20 µm 07-20001 A B C D 20 µm ATCC 15834 Gambar 13. Rambut akar dari akar sekunder bibit tanaman manggis umur 15 bulan setelah inokulasi Gambar 14. Hasil Scanning Electron Microscop SEM rambut akar dari akar sekunder bibit tanaman manggis umur 15 bulan setelah inokulasi C D Kontrol 50µm 50µm 50µm 50µm 50µm R1000 A4 509 07-20001 ATCC 15834 Kontrol 50µm 50µm 50µm 50µm 50µm 50µm 50µm 50µm 50µm 50µm R1000 A4 509 07-20001 ATCC 15834 50 µm A4 50 µm R1000 50 µm 07-20001 Kontrol 50 µm 509 50 µm ATCC- 15834 50 µm 50 µm A4 50 µm 50 µm R1000 50 µm 50 µm 07-20001 Kontrol 50 µm 50 µm 509 50 µm 50 µm ATCC- 15834 Pertumbuhan Tajuk Bibit Manggis Bibit manggis yang diinokulasi oleh berbagai strain A. rhizogenes pada berbagai umur bibit manggis dan konsentrasi A. rhizogenes selain dapat meningkatan perkembangan akar ternyata juga mampu meningkatkan pertumbuhan tajuk bibit manggis. Pertumbuhan tajuk yang diamati setelah 15 bulan setelah inokulasi adalah pertambahan tinggi, jumlah daun, diameter batang dan berat kering tajuk. Berdasarkan Tabel 8 terlihat bahwa pertambahan tinggi bibit manggis 15 bulan setelah inokulasi nyata dipengaruhi oleh konsentrasi strain A. rhizogenes dan umur bibit manggis sedangkan interaksinya tidak berbeda nyata. Bibit yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834, 07-20001, 509 dan R1000 pada konsentrasi OD 600 =1.0 menghasilkan pertambahan tinggi yang nyata lebih besar dibandingkan dengan bibit yang tidak diinokulasi kontrol. Bibit yang diinokulasi saat umur 6 minggu menghasilkan pertambahan tinggi yang nyata lebih besar dibandingkan inokulasi pada saat bibit umur 3 dan 9 minggu. Pertambahan jumlah daun bibit manggis juga nyata dipengaruhi oleh konsentrasi strain A. rhizogenes dan umur bibit manggis, sedangkan interaksinya tidak berbeda nyata. Dari Tabel 8 terlihat bahwa inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 konsentrasi OD 600 =1.0 pada bibit umur 6 minggu menghasilkan pertambahan jumlah daun yang nyata lebih besar dibandingkan tanaman kontrol. Inokulasi A. rhizogenes pada akar bibit manggis umur 6 minggu menghasilkan pertambahan jumlah daun yang nyata lebih besar dibanding inokulasi saat umur 3 dan 9 minggu. Tabel 8. Pertambahan tinggi cm dan jumlah daun helai bibit manggis umur 15 BSI Konsentrasi strain A. rhizogenes OD 600 Pertambahan tinggi cm Pertambahan jumlah daun helai Kontrol 3.43 d 7.00 bcde R1000 0.7 3.85 bcd 7.08 bcde R1000 1.0 4.37 abc 7.50 abcd A4 0.7 3.66 bcd 6.25 cde A4 1.0 4.06 bc 8.08 abcd 509 0.7 3.57 bcd 6.33 cde 509 1.0 4.86 ab 9.00 abc 07-20001 0.7 3.71 bcd 6.50 bcde 07-20001 1.0 4.30 abc 8.25 abcd ATCC-15834 0.7 3.81 bcd 6.67 bcde ATCC-15834 1.0 5.62 a 9.50 a Umur bibit manggis saat inokulasi 3 minggu 3.13 b 5.59 c 6 minggu 5.18 a 9.02 a 9 minggu 3.79 b 7.31 b Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT α = 0.05. Selanjutnya pertambahan diameter batang nyata dipengaruhi oleh konsentrasi strain A. rhizogenes dan umur bibit manggis. Tabel 9 menunjukkan bahwa bibit manggis yang diinokulasi pada umur 6 minggu dengan strain ATCC-15834 pada konsentrasi OD 600 =1.0 menghasilkan pertambahan diameter batang yang nyata lebih besar dibandingkan kontrol, untuk bibit yang diinokulasi pada umur 3 minggu strain 07-20001 pada konsentrasi OD 600 =0.7 menghasilkan pertambahan diameter batang yang lebih besar, sementara inokulasi A. rhizogenes strain 07-20001 dan A4 konsentrasi OD 600 =0.7 pada umur 9 minggu menghasilkan pertambahan diameter batang yang nyata lebih kecil dibandingkan dengan kontrol dan strain A. rhizogenes lainnya. Tabel 9. Pertambahan diameter batang mm bibit manggis umur 15 BSI Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf kecil yang sama pada baris yang sama, atau angka yang diikuti huruf besar yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT α = 0.05 Berat kering tajuk bibit manggis umur 15 bulan setelah inokulasi ternyata dipengaruhi oleh konsentrasi strain A. rhizogenes dan umur bibit manggis. Tabel 10 menunjukkan bahwa bibit yang diinokulasi strain ATCC- 15834 konsentrasi OD 600 =1.0 pada saat umur 6 minggu menghasilkan berat kering tajuk yang terbesar dibandingkan dengan kontrol. Inokulasi A. rhizogenes pada akar bibit manggis umur 3 minggu dengan strain ATCC-15834 pada konsentrasi OD 600 =1.0 dan 0.7 menghasilkan berat kering tajuk yang lebih besar dan berbeda nyata dengan kontrol. Sedangkan inokulasi A. rhizogenes pada akar bibit manggis umur 9 minggu menghasilkan berat kering tajuk yang tidak berbeda nyata dengan bibit yang tidak diinokulasi kontrol. Pertambahan diameter batang mm Umur bibit manggis saat inokulasi Konsentrasi strain A. rhizogenes OD 600 3 minggu 6 minggu 9 minggu Kontrol 1.463 cB 1.750 bC 1.913 aA R1000 0.7 1.700 bB 1.700 bC 2.163 aA R1000 1.0 1.575 bB 2.413 aB 1.800 bA A4 0.7 1.575 bB 1.888 aC 1.613 bB A4 1.0 1.775 cB 2.113 bC 2.150 aA 509 0.7 1.665 aB 1.638 aC 1.875 aA 509 1.0 1.438 cB 1.988 bC 2.038 aA 07-20001 0.7 2.025 aA 1.963 aC 1.638 bB 07-20001 1.0 1.525 bB 2.325 aB 1.800 aA ATCC-15834 0.7 1.800 bB 2.050 aC 1.825 bA ATCC-15834 1.0 1.725 bB 2.713 aA 2.013 aA Tabel 10. Berat kering tajuk g bibit manggis umur 15 BSI Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf kecil yang sama pada baris yang sama, atau angka yang diikuti huruf besar yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT α = 0.05 Performansi bibit manggis 15 bulan setelah inokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes pada berbagai umur dan konsentrasi tertera pada Gambar 15. Bibit manggis yang diinokulasi A. rhizogenes umur 6 minggu pada konsentrasi OD 600 =1.0 memperlihatkan perkembangan akar dan pertumbuhan tajuk yang lebih baik dibandingkan inokulasi pada saat umur 3 dan 9 minggu. Inokulasi strain ATCC 15834 umur 6 minggu pada konsentrasi OD 600 =1.0 menghasilkan pertumbuhan bibit manggis yang lebih baik dibandingkan dengan bibit yang tidak diinokulasi kontrol. Berat kering tajuk g Umur bibit manggis saat inokulasi Konsentrasi strain A. rhizogenes OD 600 3 minggu 6 minggu 9 minggu Kontrol 2.41 aD 2.64 aE 2.25 aA R1000 0.7 2.04 cE 4.47 aB 2.90 bA R1000 1.0 3.29 bC 5.12 aB 2.97 bA A4 0.7 2.83 bC 2.55 cE 3.90 aA A4 1.0 2.78 cC 4.86 aB 3.50 bA 509 0.7 3.38 aC 3.09 aD 3.60 aA 509 1.0 3.75 bB 4.59 aB 3.02 cA 07-20001 0.7 3.39 aC 1.79 bF 3.34 aA 07-20001 1.0 3.08 cC 5.43 aB 3.15 bA ATCC-15834 0.7 4.22 aA 3.93 aC 4.10 aA ATCC-15834 1.0 4.55 bA 6.54 aA 3.70 cA 1. Bibit yang diinokulasi umur 3 minggu

2. Bibit yang diinokulasi umur 6 minggu

3. Bibit yang diinokulasi umur 9 minggu Gambar 15. Performansi bibit manggis umur 15 bulan setelah inokulasi I OD 600 = 1.0 dan II OD 600 = 0.7 dimana ; A kontrol, B 07-20001, C ATTC-15834, D R1000, E 509, dan F A4 Verifikasi Hasil Inokulasi A. rhizogenes Selanjutnya untuk melihat lebih jauh peranan dari akar bibit manggis yang telah diinokulasi A. rhizogenes terhadap pertumbuhan bibit, maka dilakukan analisis hara daun dan analisis hormon IAA akar bibit manggis. Hasil analisis hara menunjukkan bahwa inokulasi A. rhizogenes mampu meningkatkan serapan hara bibit manggis. Inokulasi strain ATCC-15834 dan 07-20001 mampu menghasilkan serapan hara N dan P daun yang nyata lebih besar dibandingkan strain 509, A4, R1000 dan kontrol. Sedangkan serapan hara K terbesar dihasilkan bibit tanaman manggis yang diinokulasi strain ATCC-15834 75.82 mg, dan tidak berbeda nyata dengan strain 07-20001, 509 dan kontrol Tabel 11. Tabel 11. Serapan hara daun mg bibit manggis umur 15 BSI Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom dan peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT α = 0.05. Inokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes pada akar bibit manggis juga berpengaruh terhadap konsentrasi auksin endogen bibit tanaman manggis umur 15 bulan setelah inokulasi. Tabel 12 menunjukkan bahwa inokulasi strain ATCC-15834 pada akar bibit manggis menghasilkan konsentrasi hormon IAA dalam bentuk terikat dan total IAA yang nyata lebih tinggi dibandingkan bibit manggis yang tidak diinokulasi kontrol. Sedangkan untuk konsentrasi hormon IAA yang berada dalam keadaan bebas tidak berbeda nyata antara bibit yang diinokulasi A. rhizogenes dengan bibit manggis yang tidak diinokulasi kontrol. Serapan hara mg strain A. rhizogenes N P K Kontrol 31.48 b 1.56 bc 61.88 ab R1000 19.56 b 1.08 c 22.54 c A4 17.36 b 1.57 bc 30.41 bc 509 22.61 b 1.82 bc 36.46 abc 07-20001 50.86 a 2.86 ab 56.37 ab ATCC-15834 53.16 a 4.05 a 75.82 a Tabel 12. Konsentrasi hormon IAA µgml akar bibit manggis umur 15 BSI Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom dan peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT α = 0.05. Berdasarkan penjelasan di atas ternyata akar bibit manggis yang diinokulasi dengan A. rhizogenes pada konsentrasi OD 600 =1.0 saat umur 6 minggu menghasilkan perkembangan akar dan pertumbuhan tajuk yang nyata lebih baik dibandingkan kontrol. Untuk melihat lebih jauh keberhasilan inokulasi A. rhizogenes pada akar bibit manggis tersebut, maka dilakukan analisis molekuler yang bertujuan untuk mengetahui keberadaan gen T-DNA yang telah ditransfer ke dalam genom tanaman hasil inokulasi. Teknik yang umum digunakan adalah menggunakan metode PCR Polymerase Chain Reaction dengan sepasang primer spesifik untuk gen yang ditransfer. Hasil analisis molekuler dengan teknik PCR pada akar bibit manggis yang diinokulasi pada saat umur 6 minggu terlihat bahwa strain ATCC-15834 OD 600 =1.0 dapat mentransferkan T-DNAnya yang berasal dari plasmid Ri A. rhizogenes pada sel akar tanaman bibit manggis umur 15 bulan setelah inokulasi, yang ditunjukkan adanya pita DNA ukuran 780 bp tetapi tidak ditemukan pita DNA pada strain 07-20001, A4, 509, R1000 dan kontrol Gambar 16. Konsentrasi hormon IAA µgml strain A.rhizogenes IAA bebas IAA terikat Total IAA Kontrol 4.450 a 14.214 c 18.664 c R1000 3.316 a 12.367 d 17.197 c A4 6.275 a 16.902 b 23.177 b 509 4.374 a 14.398 c 18.772 c 07-2001 5.828 a 12.639 d 18.467 c ATCC-15834 6.464 a 23.892 a 30.356 a Gambar 16. Hasil PCR akar bibit manggis yang diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes M Marker 1 kb, 1-2 kontrol negatif, 3-4 kontrol positif, 5 R1000, 6 A4, 7 509, 8 07-20001 dan 9 ATCC-15834. PEMBAHASAN Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa inokulasi strain A. rhizogenes tertentu mampu meningkatkan pertumbuhan bibit manggis baik perkembangan akar maupun pertumbuhan tajuk. Strain A. rhizogenes dan metode inokulasi sangat menentukan keberhasilan infeksi A. rhizogenes pada akar bibit manggis. Setelah 24 minggu perlakuan terlihat bahwa inokulasi strain ATCC-15834, 07- 20001, A4, 509, dan R1000 dengan metode akar dipotong lebih efektif dalam menginfeksi akar bibit manggis. Peningkatan panjang akar primer, jumlah akar sekunder, jumlah akar tersier, diameter batang dan tinggi yang dihasilkannya lebih besar dibanding kontrol. Inokulasi Agrobacterium dimulai dengan adanya pelukaan pada akar tanaman sasaran. Metode pelukaan diduga mempengaruhi keberhasilan dari inokulasi Agrobacterium, jika pelukaan yang dilakukan kurang tepat dapat menyebabkan kegagalan proses inokulasi Agrobacterium dan bahkan dapat mematikan tanaman sasaran. Dari penelitian ini diperoleh hasil bahwa metode inokulasi strain A. rhizogenes pada akar bibit manggis berpengaruh terhadap persentase hidup bibit tanaman manggis. Metode inokulasi dengan cara akar M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10.000 2000 1500 780 500 250 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10.000 2000 1500 780 500 250 bp ditusuk menghasilkan persentase bibit manggis yang hidup lebih rendah dibandingkan metode inokulasi dengan cara akar dipotong. Diduga metode inokulasi dengan cara akar ditusuk menyebabkan kerusakan pada jaringan pembuluh akar sehingga banyak akar bibit manggis yang mengalami pembusukan setelah diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes. Akar bibit manggis yang diinokulasi dengan strain A. rhizogenes 07- 20001, ATCC-15834, A4, 509 dan R1000 menghasilkan persentase tanaman hidup lebih tinggi dibanding inokulasi dengan strain ATCC-8196, 510, 511, A4-J, dan MAFF 01-1724. Hal ini mengindikasikan strain A. rhizogenes ATCC-15834, 07-20001, A4, 509 dan R1000 lebih efektif dalam menginfeksi akar bibit manggis. Efektifitas masing-masing strain A. rhizogenes dalam menginfeksi bibit tanaman manggis dalam penelitian ini terlihat bervariasi. Keadaan ini disebabkan tidak semua strain A. rhizogenes dapat meningkatkan perakaran bibit tanaman manggis. Menurut Hiei et al. 1997 keberhasilan Agrobacterium dalam menginfeksi tanaman ditentukan oleh banyak faktor diantaranya adalah jenis dan perkembangan jaringan yang akan diinfeksi serta strain Agrobacterium yang digunakan. Untuk optimalnya pemanfaatan A. rhizogenes maka harus memperhatikan strain yang digunakan, sebab kemampuan inokulasi Agrobacterium terhadap tanaman berbeda-beda dalam efektivitas transper T- DNAnya. Hal ini berhubungan dengan virulensi strain Agrobacterium yang dipakai dan kerentanan spesies tanaman Owen et al. 1988. Winan 1992 juga mengungkapkan bahwa keberhasilan proses inokulasi dan transfer T-DNA tergantung dari kompatibilitas antara spesies dan strain Agrobacterium yang dipakai. Kompatibilitas ini ditunjukkan dengan kemampuan Agrobacterium untuk menerima isyarat dari tanaman peka yang luka dan diikuti dengan terinduksinya faktor virulensi yang diperlukan dalam proses inokulasi. Strain A. rhizogenes sering juga diklasifikasikan berdasarkan opin yang dikandungnya seperti agropin, manopin atau cucumopin. Bakteri A. rhizogenes strain ATCC-15834, 07-20001, A4, A4-J, 509, 510, dan 511 merupakan bakteri dengan tipe agropin, sedang strain ATCC-8196 dan MAFF 01-1724 merupakan tipe manopin. Bakteri dengan tipe agropin mempunyai kedua DNA transfer yaitu left T-DNA TL-DNA dan right T-DNA TR-DNA, sedangkan bakteri dengan tipe manopin hanya memiliki TL-DNA saja sehingga tidak memberikan sandi genetik untuk biosintesis auksin van der Salm et al. 1996. Opin merupakan turunan asam amino yang diproduksi oleh tanaman terinfeksi A. rhizogenes dan dipergunakan bakteri sebagai sumber karbon dan nitrogen. Peningkatan pertumbuhan tajuk maupun perakaran bibit manggis yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834, A4, 07-20001, 509, dan R1000 diduga karena A. rhizogenes tersebut mampu menginfeksi akar bibit manggis sehingga dapat mentransfer T-DNA pada genom sel tanaman. Tanaman yang telah mengalami integrasi T-DNA dapat mengekspresikan enzim baru, mensintesis zat pengatur tumbuh auksin endogen. Zat pengatur tumbuh tersebut diperlukan tanaman untuk meningkatkan sintesis protein dan memacu pertumbuhan primodia akar sehingga meningkatkan pertumbuhan rambut akar. Inokulasi A. rhizogenes pada tanaman lain telah dilakukan juga oleh Strobel et al. 1988 yaitu inokulasi pada tanaman olive dengan strain 323, Lambert Tepfer 1991 inokulasi strain A4 pada apel dan Bassil et al. 1991 pada Hazelnut Corylus avellana L., inokulasi A. rhizogenes tersebut mampu meningkatkan pertumbuhan akar dan produksi tanaman. Pada penelitian ini ditemukan juga cukup banyak bibit manggis hasil inokulasi yang mati . Hal ini diduga disebabkan waktu perendaman bibit manggis dalam suspensi bakteri A. rhizogenes selama 30 menit terlalu lama sehingga terjadi persaingan antara tanaman dan kecepatan bakteri yang tumbuh serta infeksi bakteri A. rhizogenes yang terlalu banyak menyebabkan seljaringan tanaman menjadi stres dan tidak bisa tumbuh. Mihaljević et al. 1996 juga melaporkan bahwa perendaman eksplan Pinus nigra dalam suspensi A. rhizogenes lebih lama dapat menyebabkan penurunan persentase tanaman yang berakar dan terjadinya pengeringan pada daerah perlukaan. Menurut Purnamaningsih 2006, tanaman dikotil sangat sensitif terhadap infeksi Agrobacterium sedangkan tanaman monokotil lebih sulit diinfeksi oleh Agrobacterium sehingga biasanya tanaman monokotil membutuhkan waktu perendaman yang lebih lama dalam suspensi bakteri. Di samping itu juga tidak diketahui berapa kepadatan atau konsentrasi dari strain-strain A. rhizogenes yang dipergunakan saat inokulasi dilakukan. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri A. rhizogenes menghendaki kondisi yang spesifik kepadatan tertentu agar dapat lebih efektif menginokulasi akar bibit manggis. Berdasarkan hasil percobaan ini strain A. rhizogenes yang spesifik penginduksi perakaran bibit manggis, adalah strain ATCC 15834, 07-20001, 509, A4 dan R1000 A. tumefaciens dengan metode akar dipotong. Untuk memastikan bahwa strain A. rhizogenes tersebut mampu menginokulasi akar bibit manggis, maka dilakukan percobaan B yaitu pengembangan protokol inokulasi A. rhizogenes yang efektif untuk menginduksi perakaran bibit manggis dengan jumlah tanaman contoh yang lebih banyak dan pengamatan yang lebih teliti. Inokulasi A. rhizogenes pada berbagai konsentrasi dan umur bibit manggis ternyata dapat meningkatkan perakaran dan pertumbuhan bibit manggis. Inokulasi strain ATCC-15834 menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang dan total luasan xilem akar yang lebih besar serta menghasilkan pertumbuhan rambut akar yang lebih baik dibanding kontrol. Dalam hal ini berarti bibit yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834 konsentrasi 1.0 paling efektif menginfeksi akar bibit manggis dibandingkan dengan strain 07-20001, 509, A4 dan R1000 konsentrasi 1.0 dan 0.7. Perbedaan keefektivan yang terjadi dari masing-masing strain tersebut disebabkan adanya perbedaan kemampuan dalam menginfeksi akar bibit manggis, disamping itu diduga setiap strain A. rhizogenes yang digunakan dalam penelitian ini memiliki preferensi yang berbeda terhadap eksudat yang dikeluarkan oleh bibit tersebut. Menurut Tan 1997 eksudat yang dikeluarkan oleh tanaman seperti senyawa fenolik sangat mempengaruhi efektivitas dari bakteri Agrobacterium yang digunakan. Giri et al. 2001 juga menemukan adanya perbedaan efektivitas berbagai strain A. rhizogenes dalam menginduksi akar pada tanaman Artemisia annua. Inokulasi A. rhizogenes pada bibit manggis saat umur 6 minggu memperlihatkan pertumbuhan akar yang lebih baik dibandingkan dengan inokulasi pada saat umur 3 dan 9 minggu. Keadaan ini diduga karena tingkat sensitifitas jaringan yang berbeda dari ketiga umur bibit manggis tersebut, dimana bibit manggis umur 6 minggu sistem perakarannya lebih peka dibandingkan umur 3 dan 9 minggu. Menurut Him et al. 1987 bahwa umur jaringan tanaman sangat mempengaruhi keberhasilan inokulasi A. rhizogenes pada akar wortel. Hasil penelitian Jacobsen 2003 juga menunjukkan, bahwa keberhasilan inokulasi A. rhizogenes pada Pinus contorta sangat dipengaruhi oleh umur bibit saat inokulasi. Kerapatan densitas OD bakteri yang digunakan untuk menginokulasi tanaman juga berpengaruh terhadap proses infeksi. Konsentrasi A. rhizogenes pada OD 600 =1.0 setara dengan 10 9 selml lebih efektif dalam menginfeksi akar bibit manggis dibandingkan dengan konsentrasi A. rhizogenes pada OD 600 =0.7 setara dengan 10 6 selml. Menurut Siswanto et al. 1997 bahwa kepadatan bakteri A. rhizogenes juga merupakan faktor yang tidak kalah penting dalam proses infeksi. Jumlah bakteri yang diperlukan dalam proses infeksi suatu sel tanaman harus tepat, artinya tidak kurang dan tidak berlebihan jika kurang jumlah bakterinya, maka proses infeksi tidak akan efektif dan juga sebaliknya jika jumlah terlalu banyak berlebihan maka terjadi pertumbuhan bakteri yang sangat tinggi sehingga pertumbuhan tanaman dapat terhambat atau mati akibat proses infeksi yang tidak efektif. Selanjutnya bibit manggis yang diinokulasi strain ATCC-15834 pada konsentrasi OD 600 =1.0 menunjukkan total luasan pembuluh xilem dan luas serapan permukaan sayatan melintang akar bibit manggis yang lebih besar dibandingkan inokulasi dengan strain 07-20001, A4, 509, dan R1000. Luas serapan permukaan sayatan melintang daya penghantar air merupakan salah satu fungsi penting dari akar tanaman seperti uptake ion penyerapan ion yang berperan di dalam akar. Jaringan yang berperan menyerap air dan unsur hara adalah jaringan xilem, dimana luas serapan permukaan sayatan melintang sangat ditentukan oleh diameter xilem. Jika diameter xilem pada suatu tanaman rata-rata menunjukkan angka yang besar, maka daya penghantar air oleh xilem lebih cepat prosesnya dibandingkan xilem yang kecil. Xilem merupakan jaringan pengangkut air yang utama pada tumbuhan berpembuluh. Xilem juga terlibat dalam pengangkutan hara mineral, gudang makanan dan penguat struktur batang. Xilem dalam akar bersambung dengan xilem dalam batang Harran Tjondronegoro 1992. Strobel et al. 1987 juga menemukan bahwa tanaman olive yang telah ditransformasi A. rhizogenes strain 232 memiliki struktur anatomi akar yang berkembang lebih baik dibandingkan dengan tanaman olive yang tidak ditransformasi. Menurut Cox 1988 lambatnya pertumbuhan tanaman manggis antara lain disebabkan oleh buruknya sistem perakaran karena tidak mempunyai rambut akar pada setiap tahap pertumbuhannya, keadaan ini dapat dilihat pada akar yang tidak diinokulasi A. rhizogenes kontrol sedangkan pada akar bibit manggis yang terintegrasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 mampu merangsang terbentuknya rambut akar pada akar sekunder bibit manggis yang lebih baik dibandingkan inokulasi strain 07-20001, 509, A4, dan R1000. Hal yang sama juga terlihat pada percobaan yang dilakukan Ermayanti et al. 2002 pada Artemisia annua dimana, akar hasil transformasi strain bakteri ATCC-15834 pertumbuhan rambut akar tidak merata pada akar utamanya, namun pada akar cabang pertumbuhan rambut akarnya lebih lebat dan merata dari ujung akarnya. Rambut akar merupakan pelebaran lateral dari sel-sel epidermis yang berbentuk tabung memanjang sehingga dapat menyerap hara mineral lebih banyak Fahn 1995. Gilroy Jones 2000 melaporkan bahwa hara mineral yang dapat diserap oleh rambut akar antara lain Ca2 + , K + , NH 4 + , NO 3 - , Mn 2+ , Zn 2+ , Cl - dan H 2 PO 4 - yang diperlukan tanaman untuk pertumbuhan tanaman. Pertumbuhan dan perkembangan rambut akar ditentukan oleh keberadaan auksin yang terdapat dalam tanaman yang diperlukan dalam proses pembelahan sel Waisel 2002. Rambut akar terbentuk karena adanya pembelahan sel yang tidak seimbang pada sel epidermis muda mengawali pembentukan rambut akar dan sel epidermis biasa. Pembelahan ini menghasilkan trikoblas sel di sebelah atas lebih kecil dan atrikoblas sel di sebelah bawah yang lebih besar, trikoblas berkembang menjadi rambut akar Salisbury Ross 1995. Poerwanto et al. 1989 menemukan bahwa, akar satsuma mandarin Citrus unshiu Marc. Cv. Okitsu Wase yang memiliki rambut akar yang lebih panjang dan banyak ternyata juga menghasilkan total panjang akar dan berat kering akar yang nyata lebih besar. Hal ini juga terjadi pada bibit manggis setelah diinokulasi A. rhizogenes. Selain meningkatkan serapan air, ternyata luas serapan permukaan sayatan melintang akar yang semakin besar ini juga meningkatkan serapan hara N dan P daun bibit manggis. Di mana unsur hara tersebut memiliki peranan yang khusus, pada fase bibit dibutuhkan N lebih banyak untuk sintesis klorofil, asam amino, protein dan senyawa asam nukleat. Fosfor berfungsi sebagai penyusun metabolit dalam senyawa kompleks, sebagai aktivator, kofaktor atau penyusun enzim serat dan berperan dalam proses fisiologi Soepardi 1983. Jika kekurangan unsur-unsur tersebut dapat menimbulkan gangguan metabolisme, termasuk perubahan-perubahan dalam aktivitas enzim, laju reaksi metabolik dan konsentrasi metabolit. Sedangkan serapan kalium tidak memperlihatkan perbedaan antara tanaman yang diinokulasi dengan kontrol. Sebab unsur K merupakan unsur hara yang bersifat sangat mobil pada semua tingkat pertumbuhan, baik di sel dan jaringan, serta pada transpor jarak jauh melalui xilem dan floem Marscher 1995. Kandungan hormon IAA pada akar manggis juga meningkat, hal ini terjadi karena terintegrasinya sebagian fragmen DNA yaitu T-DNA dari Agrobacterium ke dalam sel akar tanaman manggis. Pada T-DNA tersebut terdapat 2 daerah yaitu left T-DNA TL-DNA dan right T-DNA TR-DNA. TR- DNA mengandung gen-gen iaaM dan iaaH yang berfungsi untuk biosintesis auksin dan juga membawa gen-gen untuk menyandi sintesis senyawa opin Giri Narasu 2000. Sedangkan TL-DNA mengandung gen-gen rol root loci yaitu : rol A, rolB, rolC dan rolD Slightom et al. 1986. Hasil pengujian White et al. 1985 menunjukkan bahwa protein produk dari berbagai gen rol berperan dalam meningkatkan sensitivitas sel tanaman terhadap auksin. Selain itu produk gen rol juga diduga mendorong tanaman inang untuk mensintesis auksin sehingga mengakibatkan terjadinya pembentukan akar. Proses pembentukan akar terjadi karena di dalam T-DNA terdapat gen penyandi protein yang berperan dalam proses biosintesis fitohormon yaitu auksin. Hormon IAA adalah auksin endogen yang dihasilkan oleh tanaman dapat ditransportasikan dan digunakan langsung oleh tanaman, akan tetapi apabila ketersediaannya berlebih maka IAA dapat diikat oleh senyawa-senyawa tertentu menjadi IAA asam aspartat, IAA-mioinositol dan IAA glukosa. Senyawa- senyawa tersebut tidak aktif sebagai auksin kecuali bila dihidrolisis kembali menjadi IAA bebas Wattimena 1988; Davies 2004. Berdasarkan hasil penelitian ini didapatkan bahwa inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 konsentrasi 1.0 pada umur 6 minggu pada akar bibit manggis juga dapat meningkatkan perumbuhan tajuk bibit manggis, hal ini sejalan dengan perkembangan akar bibit manggis yang semakin baik ternyata juga mampu meningkatkan perkembangan diameter batang, tinggi, jumlah daun dan berat kering tajuk. Strain ATCC-15834 konsentrasi 1.0 yang diinokulasikan pada bibit umur 6 minggu memiliki potensi yang paling baik untuk memacu pertumbuhan bibit manggis. Keberhasilan inokulasi masing-masing strain A. rhizogenes dalam menginfeksi akar bibit manggis dapat diketahui dari terintegrasinya T-DNA ke dalam sel akar tanaman manggis menggunakan polymerase chain reaction PCR dengan primer spesifik yaitu primer yang susunan nukleotidanya tertentu dan merupakan komplemen dari cetakan DNA yang akan dianalisis yaitu primer rol B1 dan rolB2. Hasil analisis molekuler dengan teknik PCR pada akar bibit manggis yang diinokulasi pada umur 6 minggu pada konsentrasi OD 600 =1.0 terlihat bahwa strain ATCC-15834 dapat menstransfer T-DNA dalam sel akar tanaman manggis, yang ditunjukkan adanya pita DNA ukuran 780 bp. tetapi tidak ditemukan pita DNA pada strain 07-20001, A4, 509, R1000 dan kontrol. Hal tersebut mengindikasikan terintegrasinya TL-DNA A. rhizogenes strain ATCC- 15834 pada akar bibit manggis. Churiyah 2005 juga menemukan adanya pita DNA ukuran 780 bp pada tanaman Cucurbitaceae yang berhasil diinokulasi dengan A. rhizogenes strain ATCC-15834. Menurut Ermayanti et al. 2002, deteksi adanya pita TL-DNA ini diperlukan untuk konfirmasi terjadinya transfer T- DNA antara bakteri terhadap sel tanaman. SIMPULAN Inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834, 07-20001, A4, dan 509 mampu meningkatkan pertumbuhan panjang akar primer, jumlah akar sekunder dan tersier serta pertumbuhan tajuk, yaitu : diameter batang, tinggi tanaman, dan jumlah daun tanaman bibit manggis. Metode inokulasi dengan cara akar dipotong lebih efektif dalam menginfeksi akar bibit manggis dibandingkan dengan akar ditusuk. Bakteri A. rhizogenes strain ATCC-15834 konsentrasi OD 600 = 1.0 dapat menginokulasi akar bibit tanaman manggis umur 6 minggu. Anatomi akar bibit manggis hasil inokulasi strain ATCC-15834 menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang dan total luasan xilem akar yang lebih besar serta menghasilkan pertumbuhan rambut akar yang lebih baik dibandingkan bibit yang tidak diinokulasi. Serta menghasilkan serapan hara N dan P daun, dan kandungan total hormon IAA yang paling tinggi. Hasil verifikasi inokulasi A. rhizogenes dengan amplifikasi PCR menunjukkan bahwa strain ATCC-15834 dapat mentransfer daerah TL-DNAnya pada akar bibit manggis yang dibuktikan dengan terdeteksinya gen rolB 780 bp pada elektroforesis. Induksi Akar Manggis Garcinia mangostana L. dengan Agrobacterium rhizogenes Secara In Vitro Abstrak Perbanyakan bibit manggis dengan perkecambahan biji menghadapi berbagai kendala seperti biji hanya tersedia pada musim tertentu ketika musim berbuah 1-2 kali setahun dan setiap buah hanya menghasilkan 1-2 biji yang berukuran besar dan layak untuk dijadikan benih. Perbanyakan manggis dengan cara in vitro diharapkan dapat menyediakan bibit manggis secara masal, seragam, dan sepanjang tahun. Kendala utama dalam perbanyakan tanaman manggis secara in vitro adalah dalam merangsang perakarannya. Tujuan penelitian adalah mempelajari pengaruh penggunaan media dasar WPM dan MS dan ZPT BAP dan kinetin terhadap kecepatan multiplikasi tunas manggis dalam kultur in vitro dan mendapatkan strain A. rhizogenes yang paling baik dalam menginduksi perakaran manggis secara in vitro dengan A. rhizogenes. Percobaan ini dilakukan dalam 2 tahap yaitu : multiplikasi tunas manggis dan induksi perakaran eksplan dengan A. rhizogenes . Rancangan yang digunakan untuk multiplikasi tunas adalah Rancangan Acak Lengkap yang terdiri dari empat perlakuan yaitu; M 1 WPM + 5 mgl BAP, M 2 MS+5 mgl BAP, dan M 3 WPM +10 mgl Kinetin, untuk induksi akar dengan A. rhizogenes percobaan juga ditata dalam Rancangan Acak Lengkap dengan satu faktor, yaitu strain A. rhizogenes : G = WP + 5 mgl IBA, G 1 509, G 2 ATCC-15834, G 3 ATCC- 8196, G 4 01-1724, G 5 A4, G 6 07-2001, dan G 7 R-1000. Hasil penelitian menunjukkan bahwa : Penggunaan media WPM + 5 mgl BAP menghasilkan persentase perkecambahan dan presentase pembentukan tunas majemuk yang lebih baik dibandingkan biji yang ditanam pada media MS + 5 mgl BAP dan WPM + 10 mgl Kinetin. Perlakuan inokulasi berbagai strain A. rhizogenes 509, 07-20001, ATCC-15834, R1000, A4 dan ATCC-8196 dapat menginduksi perakaran pada semua eksplan manggis tanpa biji, sedangkan pada eksplan manggis dengan biji akar hanya muncul pada strain 509, 07-20001, ATCC- 15834. Eskplan manggis dengan biji yang berhasil berakar setelah inokulasi A. rhizogenes berhasil tumbuh pada tahap aklimatisasi, sedangkan eksplan manggis tanpa biji tidak ada yang berhasil tumbuh setelah 2 minggu aklimatisasi. Inokulasi A. rhizogenes strain 509 pada kultur in vitro menghasilkan anatomi akar rata-rata diameter pembuluh xilem, jumlah total pembuluh xilem, luas serapan permukaan dan total luasan sayatan melintang yang lebih besar dibandingkan kontrol. Kata Kunci : Aklimatisasi, anatomi, A. rhizogenes, eksplan, multiplikasi In Vitro Root Induction in Mangosteen Garcinia mangostana L. Using Agrobacterium rhizogenes Abstract Mangoteen propagation using seed germination faces some obstacle such as seeds availability where which only available during harvesting season one or twice a year with 1-2 seeds only for each fruits that can be used for propagation. In vitro mangosteen propagation, therefore is expected to be able provide uniform propagules in a huge amount all along the year. Root induction, however, is a major problems of mangosteen in vitro propagation. This research is focused on shoot multiplication prior to finding the best strain of Agrobacterium rhizogenes for mangoteen in vitro root induction. Randomized Complete Design was applied to shoot multiplication set of experiment, consisted of M1WPM + 5 mgL BAP; M2MS + 5 mgL BAP and M3WPM + 10 mgL Kinetin. The design was also applied to root induction experiment consisted of a single factor only, A. rhizogenes with : G = WP + 5 mgl IBA, G 1 509, G 2 ATCC-15834, G 3 ATCC- 8196, G 4 01-1724, G 5 A4, G 6 07-2001, dan G 7 R-1000. The result showed that M1 medium produced more germinated seed and higher number of multiple shoot than other media. While root induction experiment showed that all strains used induced root formation of cotyledonless explants. When complet seedling was subjected to the strains, strain 509, 07-20001, ATCC-15834 induced root formation. Explant with cotyledon that were root formation were induced were able to survive at acclimation stage, but none for cotyledoneless explants. Anatomy observation showed that 509 resulted in higher xylem diameter, total number of xylem, conductivity, and higher ration of conductivitytotal root trasversal area in comparation to other control. Key words : Acclimation, anatomy, A. rhizogenes, explant, multiplication PENDAHULUAN Ketersediaan bibit yang bermutu dalam jumlah banyak, cepat, dan seragam merupakan langkah awal untuk menunjang pengembangan tanaman manggis. Ketersediaan bibit tersebut ditempuh melalui cara mikropropagasi secara in vitro. Kultur tanaman secara in vitro sudah sangat berkembang dan digunakan dalam berbagai penelitian mutakhir maupun secara komersial. Triatminingsih et al. 2001 melaporkan bahwa pembibitan manggis secara kultur in vitro dari satu eksplan yang berasal dari eksplan biji setelah disubkulturkan dapat menghasilkan 30 tunas dalam waktu enam bulan. Planlet- planlet yang dihasilkan belum merupakan planlet intak planlet sempurna karena belum mempunyai akar. Kendala utama dalam perbanyakan tanaman manggis secara in vitro adalah dalam merangsang perakarannya. Pengakaran tunas perlu diupayakan untuk menghasilkan bibit dengan sistem perakaran yang baik. Sehingga pertumbuhan planlet manggis dapat dipacu untuk tumbuh lebih cepat. Hasil penelitian perakaran manggis telah dilaporkan oleh Goh et al. 1990, yaitu dengan penambahan IBA 20 mgl, penambahan NAA menghasilkan persentase eksplan yang berakar lebih rendah daripada penambahan IBA. Hasil penelitian Pertamawati 1997 menunjukkan bahwa media MS + 2iP 15 ppm + IBA 0.5 ppm memberikan persentase tertinggi bagi eksplan yang berakar, sedangkan Roostika et al. 2005 menyatakan bahwa persentase tertinggi diperoleh dari perlakuan ¼ MS + IBA 5 mgl. Hasil yang diperoleh dari berbagai percobaan tersebut memperlihatkan bahwa pertumbuhan planlet manggis dapat dipacu untuk tumbuh lebih cepat, tetapi percepatan pertumbuhan yang terjadi tidak terlalu besar, sehingga planlet dianggap masih tetap tumbuh lambat. Oleh karena itu perlu dicari upaya lain yang mampu mempercepat pertumbuhan planlet manggis secara signifikan. Penggunaan bakteri Agrobacterium rhizogenes untuk mengatasi masalah pengakaran pada tanaman buah-buahan dan tanaman tahunan berkayu telah banyak percobaan yang dilakukan. Bakteri A. rhizogenes dapat menginduksi pembentukan akar pada tanaman yang terinfeksi. Akar yang terbentuk dapat tumbuh dengan cepat dan biasanya tidak memerlukan hormon pertumbuhan eksogen. Pada kultur in vitro, A. rhizogenes strain A4 dan 232 berhasil menginduksi perakaran eksplan tunas apel ’Golden delicious’ Patena et al . 1988. Strain A4 juga dapat menginduksi akar pine Pinus dan Larch Larix spp McAfee et al. 1993. Infeksi A. rhizogenes strain 1855, dengan dan tanpa penambahan hormon pada kultur in vitro almond, apel, plum, pyrus pyraster dan dua hibrid rootstocks, Citation plum X peach dan GF677 almond X peach menghasilkan tiga respon, yaitu : genotif yang berakar tanpa auksin, genotif yang berakar hanya dengan auksin dan genotif yang berakar setelah diinfeksikan A. rhizogenes Damiano Monticelli. 1998. Induksi akar dengan A. rhizogenes strain LBA9402 ternyata lebih efektif dalam meningkatkan persen akar dan jumlah akar pada eksplan radiate pine Pinus radiata dibandingkan strain A4T Li Leung 2003. Sampai sejauh ini pemanfaatan bakteri A. rhizogenes untuk menginduksi akar eksplan manggis belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu perlu diteliti lebih lanjut peranan bakteri A. rhizogenes dalam menginduksi perakaran eksplan manggis. Tujuan penelitian ini adalah mempelajari pengaruh penggunaan media dasar WPM dan MS dan ZPT BAP dan kinetin terhadap kecepatan multiplikasi tunas manggis dalam kultur in vitro dan mendapatkan strain A. rhizogenes yang paling efektif menginduksi perakaran eksplan manggis. Bahan dan Metode Penelitian dilaksanakan dari Maret 2006 – Maret 2007, kegiatan penelitian dilakukan di laboratorium kultur jaringan dan rumah kaca Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika LPPM-IPB, Bogor. Percobaan A. Multiplikasi tunas tanaman manggis melalui kultur in vitro Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh penggunaan media dasar WPM dan MS dan ZPT BAP dan kinetin terhadap kecepatan multiplikasi tunas manggis dalam kultur in vitro.

a. Rancangan percobaan dan pengamatan