Perbaikan Sistem Perakaran Tanaman dengan Transformasi Agrobacterium rhizogenes

kultur sehingga eksplan yang mempunyai klorofil dapat melakukan proses fotosintesis dengan optimal. Kultur seperti ini dikatakan bahwa eksplan tumbuh dalam keadaan fotoautotrofik perbanyakan mikro dengan media bebas gula. Ermayanti et al. 1999 menyatakan bahwa planlet manggis yang ditanam dalam media bebas gula, menggunakan substrat vermikulit dan dengan pengaturan CO 2 menghasilkan persen perakaran dan panjang akar yang lebih tinggi dibandingkan kontrol. Pertamawati 2003 juga mendapatkan bahwa, planlet manggis yang dikulturkan secara in vitro dalam keadaan fotoautotrofik nyata lebih baik pertumbuhannya, akar planlet lebih panjang dan daunnya lebih luas dibandingkan dengan keadaan miksotrofik medium tumbuh mengandung gula.

2.3. Perbaikan Sistem Perakaran Tanaman dengan Transformasi Agrobacterium rhizogenes

2.3.1. Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium adalah bakteri tanah termasuk famili Rhizobiaceae bersifat aerobik, bereaksi negatip terhadap pewarnaan gram, dapat tumbuh secara saprofit atau parasit dan menyebabkan penyakit tumor grown gall dan akar rambut hairy root pada tanaman dikotil dan monokotil. Sel-selnya yang normal berukuran 0,6–1,0 µm dan memiliki 1-6 flagela Schaad 1988. Menurut Winans 1992 genus ini terdiri dari dua spesies yang bersifat patogen yaitu Agrobacterium tumefaciens dan Agrobacterium rhizogenes keduanya menginfeksi berbagai tanaman pada bagian yang luka. Infeksi sel bakteri pada bagian yang luka menyebabkan sel tanaman berproliferasi membentuk tumor dan akar. Infeksi oleh A. tumefaciens menyebabkan tumor yang tidak terorganisasi dan infeksi oleh A. rhizogenes menyebabkan proliferasi akar. Induksi tumor dan akar yang terjadi disebabkan oleh terjadinya transfer sebagian fragmen DNA atau yang disebut dengan T-DNA dari Agrobacterium ditransfer ke dalam sel tanaman. T-DNA memiliki gen-gen untuk mensintesis auksin dan sitokinin, sehingga apabila berinfeksi dengan DNA tanaman mengakibatkan terjadinya over produksi fitohormon tersebut di dalam sel tanaman Klee et al. 1987; Winans 1992. T-DNA ini terdapat pada plasmid besar yang disebut Ti-plasmid tumor inducing pada Agrobacterium tumefaciens dan Ri root inducing pada Agrobacterium rhizogenes Winans 1992; Gelvin 2003. Plasmid Ri yang terdapat pada A. rhizogenes umumnya berukuran sekitar 140–235 kbp dan fragmen DNA yang ditransfer ke dalam sel tanaman sekitar 14-42 kb yang merupakan daerah TR dan TL-DNA. Plasmid Ri yang terdapat pada A. rhizogenes mempunyai satu atau dua macam T-DNA yaitu left T-DNA TL-DNA dan right T-DNA TR-DNA. Berbeda dengan TL-DNA, TR-DNA mempunyai persamaan dengan T-DNA A. tumefaciens. TR-DNA mengandung gen-gen iaaM dan iaaH yang berfungsi dalam biosintesis auksin dan membawa gen-gen untuk menyandi sintesis senyawa opin Giri Narasu 2000. Sedangkan TL- DNA mengandung gen-gen rol root loci yaitu : rolA, rolB, rolC dan rolD Slightom et al. 1986. Hasil pengujian White et al. 1985 menunjukkan bahwa protein produk dari berbagai gen rol berperan dalam meningkatkan sensitivitas sel tanaman terhadap auksin. Selain itu produk gen rol juga diduga mendorong tanaman inang untuk mensintesis auksin. Ri-plasmid dapat dibedakan berdasarkan tipe opin yang dihasilkan yaitu agropin, manopin atau kukumopin van der Salm et al., 1996. Senyawa- senyawa tersebut merupakan sumber karbon dan nitrogen bagi Agrobacterium yang tidak dihasilkan oleh tanaman normal. Bakteri dengan tipe agropin mempunyai kedua bagian DNA, sedangkan bakteri dengan tipe manopin hanya memiliki TL-DNA. A. rhizogenes galur agropin yang mengandung TL dan TR-DNA mengandung lokus rol yang bertanggung jawab terhadap pembentukan penyakit akar rambut. TL-DNA ini homolog dengan T-DNA tunggal dari galur A. rhizogenes yang lain. TR-DNA membawa gen agropin ags, mannopin mas2’ dan mas1’ dan auksin iaaM dan iaaH yang terlibat dalam biosintesis auksin yang juga ditemukan pada T-DNA strain A. tumefaciens Jeng-Sheng, 2001 Gambar 4. A.rhizogenes tipe agropin mempunyai kisaran inang yang lebih luas dibandingkan dengan A. rhizogenes tipe lainnya. Umumnya galur Agrobacterium yang digunakan dalam proses transformasi merupakan galur dengan inang luas dengan demikian strain bakteri tersebut patogenik terhadap banyak spesies tanaman. Gambar 4. Peta genetik Agrobacterium rhizogenes Sumber : Jeng-Sheng 2001. 2. 3.2. Interaksi Agrobacterium dengan Tanaman Proses transfer T-DNA dari Ti atau Ri plasmid ke dalam genom inti tanaman terjadi akibat adanya interaksi antara A. tumefaciens atau A. rhizogenes dengan sel tanaman yang luka. Sel tanaman yang luka menghasilkan senyawa gula, asam amino atau senyawa fenol Winans, 1992. Dengan adanya isyarat tersebut maka Agrobacterium bergerak aktif menuju sel tanaman yang luka. Untuk memperkuat interaksi ini Agrobacterium mengeluarkan β-1,2-glukan. Beberapa gen dalam kromosom Agrobacterium diketahui merupakan penyandi enzim yang berperan dalam sintesis berbagai senyawa glukan, yaitu chvA, chvB dan pscA exoC serta gen cel yang berfungsi mensintesa selulosa fibril Zambryski et al. 1989. Terbentuknya senyawa fenol seperti asetosiringon AS dan hidroksiasetosiringon OH-AS dari sel tanaman yang luka menyebabkan aktifnya ekspresi gen-gen vir virulensi. Aktivasi ekspresi gen vir dilakukan oleh protein sensor bertugas mendeteksi adanya senyawa fenol yang disandikan oleh gen virA. Produk dari virA menginduksi fosforilasi dari produk virG yang kemudian mengaktifkan ekpresi dari berbagai gen vir lainnya Powell et al. 1989; Zambryski et al. 1989; Winans 1992; Gelvin 2003. Gen-gen lain yang aktif diantaranya adalah gen virD 1 dan virD 2 . Produk kedua gen ini merupakan endonuklease yang dapat menimbulkan nick terputusnya rantai DNA pada basa ketiga dan keempat pada LB dan RB sehingga dapat terjadi proses sintesis utas tunggal ssT-DNA. Jika virD 1 dan vir D 2 berada dalam kondisi terbatas, digunakan juga produk virC untuk meningkatkan sintesis ssT-DNA Gelvin, 2003. Selanjutnya ss T-DNA ditransfer dengan cara membentuk T-kompleks dengan produk virE 2 virE 2 -T- DNA. VirE 2 mengikat ssT-DNA pada situs yang tidak spesifik, berfungsi untuk menjaga kestabilan ssT-DNA dari kerusakan akibat nuklease Jeng-Sheng, 2001; Gelvin, 2003. Menurut Winans 1992 produk dari virD 2 akan tetap terikat pada ujung 5 dari T-kompleks dan diduga berfungsi sebagai protein pemandu dalam pelepasan T-kompleks dari Agrobacterium ke sel tanaman, sedangkan virD 1 tidak lagi berikatan dengan T-kompleks karena tidak diperlukan dalam proses transfer T-DNA. Produk dari virB menyebabkan terbentuknya pori atau lubang yang dilewati oleh T-DNA pada proses transfer T-kompleks dari bakteri ke tanaman.

2.3.3. Integrasi dan Ekspresi pada Genom Tanaman

Secara umum proses infeksi A. rhizogenes mirip dibandingkan dengan A. tumefaciens . Proses transfer ssT-DNA bersifat polar, yaitu bergerak dari batas kanan ke batas kiri dimulai dari ujung 5’ ke ujung 3’ 5’–3’ mirip dengan proses konjugasi. Satu atau beberapa kopi ssT-DNA dapat terintegrasi ke dalam genom tanaman pada satu situs yang sama atau terpisah-pisah pada situs yang berbeda Armitage et al. 1987. Masuknya suatu gen asing dari suatu organisme ke sel lain tanaman mengalami beberapa tahap yaitu pengikatan dan pengambilan bahan genetik pada tanaman dan penurunan sifat genetik pada tanaman yang diregenerasikan. Tanaman yang telah mengalami integrasi T-DNA selanjutnya mengekspresikan enzim baru, mensintesis fitohormon sehingga terjadi over produksi fitohormon. Fitohormon tersebut diperlukan tanaman untuk meningkatkan sintesis protein dan memacu pertumbuhan akar primordia yang meningkatkan pertumbuhan akar. Gen-gen yang terdapat pada T-DNA dibedakan menurut peranannya yaitu gen-gen yang mempengaruhi keseimbangan fitohormon dalam sel tanaman inang oncogene atau gen yang mempengaruhi produksi opin opin sintetase. Pada TR-DNA gen yang berfungsi untuk pembentuk auksin adalah iaaM tms 1, dan iaaH tms 2, dan juga membawa gen untuk menyandi sintesis senyawa opin. Gen iaaM menyandi pembentukan triptofan 2-monooksigenase yang mengkatalisis perubahan L- triptofan menjadi senyawa indole-3-asetamida. Sedangkan iaaH menyandi enzim amino hidrolase yang mengubah indole-3-asetamida menjadi asam indole-3-asetat IAA van der Salm et al. 1996; Jeng-Sheng 2001. Daerah TL-DNA berukuran 20 kb, mengandung empat root loci rol A- D yang terlibat dalam induksi akar, yakni rolA, rolB, rolC dan rolD yang berhubungan dengan open reading frames ORFs 10, 11, 12, dan 15 Chriqui 1996. Jeng-Sheng 2001 menjelaskan bahwa gen rolB ORF11 mengkode β- glucosidase yang menghidrolisis indol β-glucosida yang diduga berperan meningkatkan pool auksin aktif dalam tanaman dengan hidrolisis konjugat IAA inaktif, mengatur sensivitas sel terhadap IAA dan mendorong pembentukan meristem. Gen rolC ORF12 diduga berperan meningkatkan level sitokinin melalui aktivitas β-glucosidase yang mampu melepaskan sitokinin aktif dari konjugatnya. Gen rolA ORF10 terlibat lansung dalam induksi akar sedangkan rol D ORF15 berperan menginduksi pembungaan, namun fungsi biokimia dari kedua gen rol ini belum diketahui Jeng-Sheng 2001; Valpuesta 2002. Rugini et al . 1992 telah membuktikan bahwa kemampuan perakaran, jumlah akar dan massa akar meningkat ketika gen rolABC terekspresi pada tanaman kiwi.

2.3.4. Perbaikan Sistem Perakaran dengan Agrobacterium rhizogenes

Perakaran masih menjadi masalah utama yang sulit dipecahkan pada tanaman tahunan berkayu yang diperbanyak dengan metode perkecambahan biji maupun kultur in vitro. Percobaan untuk memperbaiki sistem perakaran selama ini lebih banyak dilakukan dengan penambahan zat pengatur tumbuh dan bahan kimia lainnya. Hasil yang diperoleh memperlihatkan bahwa awal pembentukan akar dapat dipacu lebih cepat, tetapi percepatan peningkatan akar yang terbentuk tidak terlalu besar. Oleh karena itu perlu dicari upaya lain yang dapat mengatasi masalah perakaran pada tanaman tahunan. Saat ini telah banyak percobaan yang dilakukan untuk mengatasi masalah pengakaran pada tanaman buah-buahan dan tanaman tahunan berkayu dengan menggunakan A. rhizogenes. A. rhizogenes dapat menginduksi pembentukan akar pada tanaman yang terinfeksi. Akar yang terbentuk dapat tumbuh dengan cepat dan biasanya tidak memerlukan hormon pertumbuhan eksogen. Akar tersebut sering disebut dengan ”hairy root” akar rambut karena umumnya memperlihatkan morfologi yang berbeda dengan akar tanaman induknya. Akar-akar tersebut biasanya membentuk cabang-cabang lateral dan rambut-rambut akar yang lebih banyak dibandingkan akar normal. A. rhizogenes telah banyak ditransformasikan pada berbagai jenis tanaman, terutama pada tanaman buah-buahan dan kehutanan. Strobel et al. 1987 berhasil meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman olive Olea europaea L. dengan transformasi Ri-plasmid A. rhizogenes galur 232, dan anatomi akar menunjukkan bahwa sistem jaringan pembuluh tanaman olive hasil transformasi sama dengan tanaman kontrol. Strobel Nachmias 1985 melaporkan bahwa transformasi A. rhizogenes galur 232 pada akar almond meningkatan jumlah dan massa akar, diameter batang serta jumlah daun setelah 90 hari transformasi. Dilaporkan juga bahwa terjadinya peningkatkan pertumbuhan dan produksi setelah transformasi A. rhizogenes galur 232 pada bagian akar tanaman olive Strobel et al . 1988. McAfee et al. 1993 berhasil menginduksi perakaran Pinus dan Larix spp menggunakan A. rhizogenes galur A4. Damiano Monticelli 1998 berhasil menginduksi perakaran semua kultivar almond dan apel setelah transformasi dengan A. rhizogenes galur 1855. Pada kultur in vitro, A. rhizogenes galur A4 dan 232 berhasil menginduksi perakaran eksplan tunas apel ’Golden delicious’ Patena et al. 1988. Infeksi A. rhizogenes galur 1855, dengan dan tanpa penambahan hormon pada kultur in vitro almond, apel, plum, pyrus pyraster dan dua hibrid rootstocks, Citation plum X peach dan GF677 almond X peach menghasilkan tiga respon, yaitu : genotif yang berakar tanpa auksin, genotif yang berakar hanya dengan auksin dan genotif yang berakar setelah diinfeksikan A. rhizogenes Damiano Monticelli. 1998. Induksi akar dengan A. rhizogenes galur LBA9402 ternyata lebih efektif dalam meningkatkan persen akar dan jumlah akar pada eksplan radiate pine Pinus radiata D. dibandingkan galur A4T Li Leung 2003. Pembentukan akar oleh transformasi A. rhizogenes sangat dipengaruhi lingkungan tumbuh, diantaranya suhu, kelembaban udara, pH dan cahaya. Menurut Whiteman et al. 1988 bahwa efektivitas A. rhizogenes dalam menginduksi pembentukan akar dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu pH mendekati netral 6.0, suhu 25 o C dan bagian tanaman yang diinokulasi. Biosintesis IAA Infeksi A. rhizogenes pada bagian yang luka dapat menyebabkan sel berproliferasi membentuk akar. Akar yang tumbuh disebabkan oleh adanya transfer sebagian fragmen DNA atau yang disebut dengan T-DNA dari Agrobacterium ditransfer ke dalam sel tanaman. T-DNA memiliki gen-gen untuk mensintesis fitohormon, sehingga apabila terekspresi mengakibatkan terjadinya over produksi fitohormon tersebut di dalam sel tanaman Klee et al., 1987; Winans, 1992. Fitohormon adalah zat pengatur tumbuh yang dihasilkan oleh tanaman dan aktif dalam jumlah yang kecil 10 -6 –10 -5 mM. Dikenal beberapa macam golongan fitohormon salah satunya Indole Asetic Acid IAA. Asam-asam amino aromatik triptofan Trp termasuk dalam jalur utama biosintesis dari IAA. Hasil- hasil intermediet yang terdapat antara triptofan dan IAA adalah asam indol piruvat, triptoamin, dan indol asetaldehida. Triptofan sendiri dihasilkan dari senyawa berkarbon 7, yakni 3-deoksi-7-fosfo-D-asam arabinoheptulosonat yang merupakan hasil kondensasi dari D-eritrosa-4-fosfat senyawa berkarbon 4 dan fosfo-enol-piruvat senyawa berkarbon 3. Hormon IAA juga dapat dibentuk secara langsung dari asam amino serine dengan indol Wattimena, 1988. Menurut Davies 2004 bahwa jalur pembentukan IAA melalui senyawa intermediat indole-3-pyruvate IPA dan indole-3-acetamide IAM biasa terjadi pada oleh mikroorganisme, sedangkan jalur lain terdapat dalam tanaman. Jalur IAM terdapat pada semua bakteri Agrobacterium, Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium fredii , Azospirillum brasilense, dan Streptomyces Manulis et al., 1998. Sedangkan biosintesis IAA melalui IPA dijumpai pada tanaman tingkat tinggi dan beberapa jenis bakteri meliputi Rhizobium spp, Azospirillum spp, Ralstonia solanacearum dan Enterobacter cloaceae Brandl et al., 1996. Gen-gen pada jalur IAM menyandikan tryptophan monoxygenase iaaM dan IAM hydrolase iaaH, sedangkan enzim kunci pada jalur IPA adalah indole-pyruvate decarboxylase Gambar 5. Hormon IAA yang dihasilkan oleh tanaman dapat ditransportasikan dan digunakan langsung oleh tanaman, akan tetapi apabila ketersediaannya berlebih maka IAA dapat diikat oleh senyawa- senyawa tertentu menjadi IAA asam aspartat, IAA-mioinositol dan IAA glukosa. Senyawa-senyawa tersebut tidak aktif sebagai auksin kecuali bila dihidrolisis kembali menjadi IAA bebas. Pengaturan ini penting bagi tanaman untuk mengatur ketersediaan IAA di dalam tanaman sesuai dengan kebutuhan tanaman Wattimena 1988; Davies 2004. Gambar 5. Biosintesis IAA pada tanaman dan bakteri Sumber : Walkel Estelle 1998 Kultur Jaringan Tanaman Kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuh-kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan, atau organ dalam kondisi aseptik secara in vitro di laboratorium. Teknik ini dicirikan oleh kondisi kultur yang bebas kuman, penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap dan ZPT Zat Pengatur Tumbuh, serta kondisi ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya terkontrol Yusnita, 2003 Wattimena 2006 menyatakan bahwa perbanyakan secara in vitro dapat dilakukan dengan beberapa metode antara lain melalui multiplikasi tunas dari mata tunas aksilar, melalui pembentukan tunas adventif, atau somatik embriogenesis secara langsung pembentukannya terjadi lansung dari bagian jaringan eksplan dan tidak lansung pembentukannya terjadi setelah melalui tahap pembentukan kalus atau protokorm. Semua sistem propagasi dan kultur jaringan dimulai dengan pemotongan bagian kecil dari tanaman, membebaskannya dari kontaminasi mikroorganisme dan menempatkannya dalam media kultur. Bagian tanaman yang dikulturkan tersebut dikenal dengan sebutan eksplan dan merupakan bahan untuk perbanyakan kultur in vitro. Teknik perbanyakan in vitro umumnya dilakukan melalui lima tahap Werbrouck Debegh, 1994 ; Tahap 0 : Persiapan dan perlakuan tanaman sumber eksplan Tahap 1 : Inisiasi eksplan Tahap 2 : Multiplikasi tunas Tahap 3 : Pemanjangan, induksi akar dan perkembangan akar Tahap 4 : Aklimatisasi dan penanaman di lapangan Tahap 0 dilakukan untuk mendapatkan bahan tanam eksplan yang sehat dan kondisi fisiologisnya bagus. Pada tahap ini, tanaman sebagai sumber eksplan perlu dirawat dengan baik dan kadang-kadang perlu perlakuan khusus seperti pemangkasan, penyemprotan zat pengatur tumbuh sehingga kondisi fisiologinya lebih baik. Pada tahap inisiasi, kegiatan yang dilakukan adalah memilih bagian tanaman yang akan dijadikan eksplan, mencari prosedur sterilisasi yang efektif namun tidak mematikan eksplan, dan memilih komposisi media yang tepat. Tahap multiplikasi merupakan tahap yang penting dalam perbanyakan in vitro. Multiplikasi tunas dilakukan dengan menambahkan zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin dalam media dan mensubkultur planlet pada media yang sama atau media yang berbeda. Pada beberapa kasus, penggunaan sitokinin cukup optimal untuk multiplikasi tunas Werbrouck Debergh, 1994. Tahap pengakaran dapat menghasilkan akar sehingga bisa segera diaklimatisasi. Apabila sitokinin yang digunakan pada tahap 2 relatif tinggi, kadang-kadang tunas yang dihasilkan pendek dan sulit berakar. Agar dihasilkan tunas yang panjang dan berakar, planlet ditransfer ke media yang berbeda. Pada tahap aklimatisasi pemilihan media dan kondisi lingkungan rumah kaca perlu diperhatikan untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Peningkatan Perakaran Bibit Manggis Melalui Inokulasi Agrobacterium rhizogenes pada Semai Manggis ABSTRAK Agrobacterium rhizogenes merupakan bakteri tanah yang mempunyai kemampuan untuk menstranfer sebagian bahan genetiknya T-DNA pada sel tanaman yang terlukaan. T-DNA tersebut membawa gen-gen yang terlibat dalam proses induksi akar. Tujuan dari penelitian ini adalah : seleksi strain A. rhizogenes spesifik penginduksi perakaran manggis, dan pengembangan protokol inokulasi A. rhizogenes yang efektif untuk menginduksi perakaran manggis. Penelitian dibagi menjadi dua percobaan, Percobaan A, menggunakan rancangan acak lengkap dengan kombinasi perlakuan dua faktor, yaitu pertama : 11 strain A. rhizogenes ATCC-15834, ATCC-8196, R-1000, 07- 20001, A4, A4 J, 509, 510, 511, MAFF 01-1724, dan tanpa inokulasi, kedua : 2 metode inokulasi tusuk dan potong, dengan enam ulangan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834, 509, 07-20001, A4, dan R-1000 mampu meningkatkan perkembangan akar, yaitu; panjang akar primer, jumlah akar lateral dan tersier serta pertumbuhan tajuk, yaitu; diameter batang, tinggi, dan jumlah daun bibit tanaman manggis yang lebih baik dibanding dan kontrol. Inokulasi A. rhizogenes dengan metode akar dipotong menghasilkan persentase tanaman hidup lebih tinggi dibanding dengan akar ditusuk. Percobaan B, menggunakan rancangan acak lengkap RAL dengan dua faktor yang disusun secara faktorial. Faktor pertama adalah konsentrasi strain A. rhizogenes, yaitu; G = kontrol, G 1 = R1000OD 600 = 0.7, G 2 = R1000 OD 600 = 1.0, G 3 = 509OD 600 = 0.7, G 4 = 509OD 600 = 1.0, 5 = A 4 OD 600 = 0.7, G 6 = A 4 OD 600 = 1.0, G 7 = 07-20001OD 600 = 0.7, G 8 = 07-20001OD 600 = 1.0, dan G 9 = ATCC-15834OD 600 = 1.0, G 10 = ATCC-15834OD 600 = 0.7. Faktor kedua umur bibit manggis yaitu; B 1 = 3 minggu, B 2 = 6 minggu, dan B 3 = 9 minggu. Bakteri A. rhizogenes yang dapat menginokulasi akar bibit tanaman manggis mampu meningkatkan pertumbuhan bibit manggis, baik perakarannya maupun pertumbuhan tajuk. Diperoleh bakteri A. rhizogenes strain ATCC-15834 konsentrasi OD 600 = 1.0 yang dapat menginokulasi akar bibit manggis umur 6 minggu. Hasil verifikasi inokulasi A. rhizogenes dengan amplifikasi PCR menunjukkan bahwa strain ATCC-15834 dapat mentransfer daerah TL-DNAnya pada akar bibit manggis yang dibuktikan dengan terdeteksinya gen rolB 780 bp pada gel elektoforesis. Kata kunci : A. rhizogenes, induksi akar, strain, gen rolB, T-DNA, Improvement of Mangosteen Seedling Root System through Agrobacterium rhizogenes Inoculation at the Mangosteen Nursery ABSTRACT The soil bacterium Agrobacterium rhizogenes can induce the abundant adventitious root formation at the infection site through the transfer of genetic material T-DNA, a part of the Root inducing Ri plasmid from bacterium to the plant genome. The aims of the study were : A selection of A. rhizogenes specific strains to induce mangosteen rooting, and B development of effective protocol inoculation of A. rhizogenes to induce mangosteen rooting. The reseach was conducted in two experiments, The experiment A was assigned in completely randomized design with two factorial treatments. The fist factor : strains A. rhizogenes ATCC-15834, ATCC-8196, R-1000, 07-20001, A4, A4-J, 509, 510, 511, MAFF 01-1724, and control, the second factor : transformation method cutting and dipping. The results showed that strains transformation of ATCC-15834, 509 , 07-20001, A4, and R-1000 increased : lateral and tertier roots number, stem diameter, plant height and leaf number better than control. Inoculation with cutting root method resulted in the higher live plant percentage compared with dipping root method. The experiment B was conducted in completely randomized design with two factorial treatments. The first factor : concentration of A. rhizogenes strains {G = control, G 1 = R1000OD 600 = 0.7, G 2 = R1000 OD 600 = 1.0, G 3 = TISTR 509OD 600 = 0.7, G 4 = 509OD 600 = 1.0, G 5 = A 4 OD 600 = 0.7, A 6 = G 4 OD 600 = 1.0, G 7 = 07-20001OD 600 = 0.7, G 8 = 07- 20001OD 600 = 1.0, and G 9 = ATCC-15834OD 600 = 1.0, G 10 = ATCC- 15834OD 600 = 0.7 }, and the second one were mangosteen seedling old when it is innoculated 3 week, 6 week and 9 week. The results showed that : A. rhizogenes strain ATCC-15834 OD 600 = 1.0 was able to infect 6 week old of mangosteen seedling root. Based on PCR product, T L -DNA from A. rhizogenes strain ATCC-15834 was transferred into genome of mangosteen seedling root cell since the rolB gene was detected at 780 bp agarose electrophoresis. Key words : A. rhizogenes, gen rolB, root inducing, strain, T-DNA PENDAHULUAN Pembibitan manggis melalui biji merupakan cara yang paling umum dilakukan karena mudah, murah dan praktis. Namun laju pertumbuhan tanaman manggis ini selanjutnya lambat. Lambatnya pertumbuhan tanaman manggis ini menyebabkan keengganan petani untuk menanam manggis. Usaha untuk mempersingkat masa vegetatif tanaman manggis dapat dilakukan dengan perbanyakan vegetatif secara sambung sambung pucuk dan secara sambung susuan. Namun penyediaan batang bawah masih merupakan kendala dikarenakan pertumbuhan bibit yang lambat, diperlukan waktu sekitar 2-3 tahun untuk mendapatkan kondisi siap sambung Anwaruddin et al. 1991. Pertumbuhan tanaman manggis yang lambat ini merupakan akibat dari kurang baik dan lemahnya sistem perakaran, rendahnya kapasitas daun untuk menangkap CO 2 sehingga laju fotosintesis rendah, rendahnya laju pembelahan sel pada meristem pucuk dan panjangnya dormansi mata tunas Wieble et al. 1992. Hasil pemeriksaan sitologis terhadap tanaman manggis memperlihatkan bahwa tanaman ini mempunyai kromosom poliploidi 2n = 96 yang sifatnya sangat lemah, laju pembelahan selnya rendah demikian pula perbesaran selnya lambat. Spesies Garcinia lainnya mempunyai kromosom 2n = 48 Verheij Coronel 1991. Masri et al. 1998 melaporkan juga bahwa tanaman manggis mempunyai sistem perakaran yang kurang berkembang dimana jumlah akar sekunder per unit panjang akar primer kapasitas pecabangan akar manggis lebih kecil 21 dari durian, 27 dari cempedak, dan 45 dari rambutan. Percobaan untuk memperbaiki sistem perakaran guna memacu pertumbuhan bibit manggis telah dilakukan dengan berbagai cara, yaitu ; perendaman biji manggis sebelum semai dalam sitokinin Poerwanto et al. 1995, GA 3 Rais et al. 1996, IBA dan triakontanol Hidayat et al. 1999, dan pemanfaatan beberapa jenis cendawan mikoriza arbuskula Poerwanto et al. 1998; Masri et al. 1999; Muas et al. 2002; Lucia 2005, namun hasilnya belum memuaskan. Dengan demikian diperlukan usaha untuk meningkatkan perkembangan akar sekaligus memacu pembentukan dan pertumbuhan rambut akar. Usaha untuk memperbaiki sistem perakaran bibit manggis juga dapat dilakukan dengan pemanfaatan bakteri tanah, yaitu bakteri Agrobacterium rhizogenes. Selain dapat memproduksi hormon IAA, bakteri A. rhizogenes ini juga dapat memodifikasi lingkungan disekitar perakaran seperti meningkatkan kandungan asam-asam organik malik, laktik, fumarik dan sitrik yang diperlukan untuk perkembangan akar McAfee et al. 1993. Pemanfaatan A. rhizogenes pada tanaman telah banyak dilakukan pada tanaman buah-buahan dan tanaman kehutanan akan tetapi pemanfaatan A. rhizogenes pada tanaman manggis belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu perlu dipelajari upaya perbaikan sistem perakaran bibit manggis melalui inokulasi A. rhizogenes. Dalam penelitian ini dilakukan dua percobaan inokulasi A. rhizogenes pada bibit tanaman manggis. Percobaan pertama bertujuan untuk menyeleksi strain A. rhizogenes yang dapat menginfeksi akar bibit manggis dan mendapatkan metode inokulasi A. rhizogenes yang terbaik pada akar bibit tanaman manggis. Strain-strain A. rhizogenes yang efektif dan metode yang terbaik untuk menginokulasi akar bibit manggis akan dipergunakan dalam penelitian tahap berikutnya percobaan kedua. Percobaan kedua bertujuan untuk pengembangan protokol inokulasi A. rhizogenes yang efektif untuk peningkatan perakaran bibit tanaman manggis. Dalam percobaan pertama, seleksi dilakukan terhadap 10 strain A. rhizogenes diperoleh dari koleksi Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong-Bogor yang diinokulasikan pada bibit manggis dengan metode akar dipotong dan ditusuk. Pengamatan dilakukan terhadap perkembangan akar dan tajuk bibit manggis setelah diinokulasikan dengan berbagai strain A. rhizogenes. Dalam percobaan kedua, menggunakan berbagai konsentrasi A. rhizogenes dan umur bibit manggis. Selain pengamatan yang dilakukan seperti pada percobaan pertama, dalam percobaan kedua juga dilakukan pengamatan anatomi dan fisiologi bibit manggis. BAHAN DAN METODE Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Maret 2004 sampai Mei 2007. Kegiatan penelitian dilaksanakan di Laboratorium dan rumah kaca Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika IPB, Laboratorium Mikrobiologi dan Anatomi Tumbuhan FMIPA IPB, Laboratorium Bioteknologi dan Zoologi LIPI Cibinong, Laboratorium BALITBIOGEN dan BALITTRO Cimanggu Bogor. Percobaan A. Seleksi Strain Agrobacterium rhizogenes Spesifik Penginduksi Perakaran Bibit Manggis Garcinia mangostana L. Penelitian ini bertujuan untuk menyeleksi strain A. rhizogenes yang dapat menginfeksi akar bibit manggis dan mendapatkan metode inokulasi A. rhizogenes yang terbaik pada akar bibit tanaman manggis.

a. Perlakuan Percobaan