Lampiran 2. Penyiapan media bakteri Aeromonas hydrophila
1.1 Media TSA Tripticase Soy Agar
Untuk membuat media TSA, dilarutkan 4 gram TSA dengan 100 ml akuades dalam erlenmeyer dan ditutup menggunakan aluminium foil, kemudian
dipanaskan dalam penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen. Kemudian disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121
C dengan tekanan uap 1 atm selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau
cawan steril secara aseptik dan disimpan di dalam lemari es dengan menggunakan plastik steril.
1.2 Media LB
Untuk membuat media LB, diperlukan bahan sebagai berikut: Yeast
0.125 gr
Tripton 0.250 gr
NaCl 0.750 gr
semua bahan dilarutkan dengan 25 ml akuades dalam erlenmeyer dan ditutup menggunakan aluminium foil, kemudian dipanaskan dalam penangas air sambil
diaduk hingga larut dan homogen. Kemudian disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121
C dengan tekanan uap 1 atm selama 15 menit.
1.3 PBS Phospat Buffer Saline
Untuk membuat PBS, diperlukan bahan sebagai berikut:
NaCl 8.0 gram
KH
2
PO
4
0.2 gram
NaH
2
PO
4
1.5 gram
KCl 0.2
gram semua bahan dilarutkan dengan 1 l akuades dalam erlenmeyer dan ditutup
menggunakan aluminium foil, kemudian dipanaskan dalam penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen. Kemudian disterilkan menggunakan autoclave
pada suhu 121 C dengan tekanan uap 1 atm selama 15 menit.
Lampiran 3. Metode uji in vitro
1. Disiapkan bakteri dalam media LB, kemudian diletakkan dalam shaker selama + 18 jam
2. Setelah + 18 jam bakteri dipanen dan dimasukkan dalam ependorf, kemudian dilakukan pengenceran
3. Kemudian secara aseptik bakteri dimasukkan ke dalam cawan petri sebanyak 0.1 ml dan disebar menggunakan batang penyebar
4. Cawan petri
didiamkan + 30 menit
5. Sementara itu disiapkan sari jeruk nipis dalam ependorf lampiran 7, lalu kertas cakram steril dimasukkan ke dalam ependorf tersebut dan didiamkan
+15 menit 6. Setelah
+ 15 menit, kertas cakram secara aseptik dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah disebar bakteri
7. Cawan petri diinkubasi dalam inkubator selama + 24 jam 8. Setelah + 24 jam diukur zona hambat yang terbentuk
1 2
4 3
5
6 7
8
Lampiran 4. Setting akuarium pada uji in vivo
Lampiran 5. Metode penyiapan dan penyuntikan bakteri
1. Disiapkan isolat murni bakteri Aeromonas hydrophila pada agar miring 2. Isolat diambil menggunakan ose secara aseptik dengan cara dibakar
menggunakan bunsen sampai merah menyala 3. Bakteri diambil dengan ose steril sebanyak satu ose
4. Bakteri kemudian dimasukkan secara aseptik ke dalam media LB 5. Media LB diletakkan dalam shaker selama + 18 jam
6. Setelah
+ 18 jam bakteri dipanen dan dilakukan pencucian menggunakan PBS sebanyak 2 kali
7. Setelah itu bakteri disentrifuse 8. Bakteri diambil dengan syringespuid steril
9. Bakteri siap disuntikan ke ikan
1 2
3
6 5
4
7 8
9
Lampiran 6. Hasil penentuan LD
50
bakteri A. hydrophila terhadap ikan lele
dumbo menurut Reed and Muench 1939
Σ Akumulasi Jumlah
ikan hidup
ekor Konsentrasi
Jumlah ikan mati
ekor Ikan
mati ekor
Ikan hidup
ekor Rasio
kematian Rasio
kematian 10
8
4 0 44 15
1515 100
10
7
4 0 44 11
1111 100
10
6
3 1 34 7
1 78
88 10
5
3 1 34 4
2 46
67 10
4
1 3 14 1
5 16
17
Log negatif LD
50
= log negatif konsentrasi diatas 50 + selang proporsi = -5 + 0.34 = -4.7
= 10
4.7
~ 10
5
cfuml
Dengan diperolehnya LD
50
= 10
5
, berarti bakteri A. hydrophila pada kepadatan 10
5
cfuml dapat membuat populasi ikan lele dumbo mati sebanyak 50 dalam waktu 7 hari
Lampiran 7. pH jeruk nipis pada masing-masing dosis
Dosis pH 5 2.4
10 2.3 20 2.3
40 2.3 60 2.3
80 2.3 100 2.2
Lampiran 8. Hasil uji in vitro
8.1 Diameter zona hambat jeruk nipis terhadap Aeromonas hydrophila
Kategori