Pembuatan Sari Jeruk Nipis Uji In Vitro

3.3.2 Pembuatan Sari Jeruk Nipis

Untuk mendapatkan sari jeruk nipis, pertama-tama buah jeruk nipis dibelah menjadi empat bagian. Kemudian masing-masing bagian diperas dan disaring agar ampas jeruk nipis dapat terpisah. Sari jeruk nipis yang telah didapatkan ditempatkan dalam wadah kaca. Kemudian dilakukan pengenceran sari jeruk nipis agar didapatkan berbagai konsentrasi. Pengenceran dilakukan dengan cara mengambil sari jeruk nipis dari wadah kaca ke dalam eppendorf, kemudian ditambahkan akuades steril sampai mendapat konsentrasi yang diinginkan Lampiran 1. Konsentrasi pengenceran sari jeruk nipis yang dilakukan adalah 5, 10, 20, 40, 60, 80, dan 100.

3.3.3 Uji In Vitro

Uji in vitro dilakukan untuk mengetahui daya antibakteri dari jeruk nipis dan menentukan dosis terbaiknya dalam menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila . Dosis terbaik yang didapatkan dari uji in vitro akan digunakan dalam uji in vivo. Uji ini dilakukan dengan menggunakan metode Kirby-Bauer Lay, 1994 atau kertas cakram. Dalam uji in vitro , pertama-tama disiapkan isolat murni bakteri A. hydrophila, kemudian secara aseptik diambil isolat bakteri tersebut sebanyak satu ose dan dibiakkan dalam media LB Lampiran 2. Setelah umur bakteri dalam media LB mencapai 18 jam, bakteri dapat dipanen dan dilakukan pengenceran berseri sampai kepadatan 10 5 sesuai dengan kepadatan bakteri yang didapatkan dari uji LD 50 . Setelah itu disiapkan media TSA Lampiran 2 dalam cawan petri sebagai media tempat hidup bakteri A. hydrophila. Isolat cair bakteri A. hydrophila dengan kepadatan 10 5 diambil sebanyak 0.1 ml menggunakan mikropipet dan disebar menggunakan batang penyebar dalam cawan petri. Pengujian antibakteri dilakukan dengan metode kertas cakram, sehingga perlu disiapkan kertas cakram steril. Kertas cakram yang digunakan adalah kertas Whatman no.42 berdiameter 6 mm yang mempunyai kemampuan dalam menyerap bahan sebanyak 15 µm. Sebelum digunakan, kertas cakram disterilkan menggunakan autoclave selama 15 menit. Setelah itu, kertas cakram direndam dalam larutan jeruk nipis berbagai konsentrasi. Setelah + 15 menit, kertas cakram diambil secara aseptik dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah disebar bakteri. Kemudian cawan petri diinkubasi selama 24 jam dan diukur zona hambat yang terbentuk Lampiran 3.

3.3.4 Uji In Vivo