3.3.3 Analisis asam lemak AOAC 1999
Metode analisis yang digunakan memiliki prinsip mengubah asam lemak menjadi turunannya, yaitu metil ester sehingga dapat terdeteksi oleh alat
kromatografi. Gas Chromatography GC memiliki prinsip kerja pemisahan antara gas dan lapisan tipis cairan berdasarkan perbedaan jenis bahan
Fardiaz 1989. Jenis alat kromatografi gas yang digunakan dalam penelitian ini adalah Shimadzu GC 2010. Hasil analisis akan terekam dalam suatu lembaran
yang terhubung dengan rekorder dan ditunjukkan melalui beberapa puncak pada waktu retensi tertentu sesuai dengan karakter masing-masing asam lemak.
Sebelum melakukan injeksi metil ester, terlebih dahulu lemak diekstraksi dari bahan lalu dilakukan metilasi sehingga terbentuk metil ester dari masing-masing
asam lemak yang didapat. Standar asam lemak yang digunakan, yaitu laurat C12:0, miristat
C14:0, palmitat C16:0, palmitoleat C16:1, stearat C18:0, oleat C18:1, linoleat C18:2, linolenat C18:3, arakhidonat C20:4, EPA C20:5 dan DHA
C22:6.
a
Tahap ekstraksi Terlebih dahulu diperoleh asam lemak dengan metode sohxlet. Pada tahap
ini akan diperoleh lemak dalam bentuk minyak. Dari sampel tersebut ditimbang sebanyak 0,02-0,03 g lemak untuk dilanjutkan pada tahap metilasi.
b Pembentukan metil ester metilasi
Tahap metilasi dimaksudkan untuk membentuk senyawa turunan dari asam lemak menjadi metil esternya. Asam-asam lemak diubah menjadi ester-ester
metil atau alkil yang lainnya sebelum disuntikkan ke dalam kromatografi gas Fardiaz 1989.
Metilasi dilakukan dengan merefluks lemak di atas penangas air dengan pereaksi berturut-turut NaOH-metanol 0,5 N, BF
3
20, NaCl jenuh dan n-heksana. Sebanyak ±0,02 g lemak minyak dari sampel dimasukkan ke dalam
tabung reaksi dan ditambahkan 1 ml NaOH-metanol 0,5 N lalu dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit pada suhu 80
o
C. Larutan kemudian didinginkan. Sebanyak 2 ml BF
3
20 dan 5 mgml standar internal ditambahkan ke dalam tabung lalu tabung dipanaskan kembali pada waterbath dengan suhu 80
o
C selama
20 menit dan didinginkan. Kemudian ditambahkan 2 ml NaCl jenuh dan 1 ml heksana, dikocok dengan baik. Lapisan heksana bagian atas larutan
dipindahkan dengan bantuan pipet tetes ke dalam tabung reaksi yang berisi 0,1 g Na
2
SO
4
anhidrat, didiamkan selama 15 menit. Larutan disaring dengan mikrofilter untuk memisahkan fase cairnya sebelum diinjeksikan ke dalam
kromatografi gas. Sebanyak 1 μl sampel diinjeksikan ke dalam Gas
Chromatography. Asam lemak yang ada dalam metil ester akan diidentifikasi oleh Flame Ionization Detector FID atau detektor ionisasi nyala dan respon yang ada
akan tercatat melalui kromatogram peak. c
Identifikasi asam lemak Identifikasi asam lemak dilakukan dengan menginjeksikan metil ester pada
alat kromatografi gas dengan kondisi sebagai berikut: jenis alat kromatografi gas yang digunakan adalah Shimadzu GC 2010 Gambar 5, gas yang digunakan
sebagai fase bergerak adalah gas nitrogen dengan aliran bertekanan 20 mlmenit dan sebagai gas pembakar adalah hidrogen dengan aliran bertekanan 30 mlmenit
dan oksigen dengan aliran 200-300 mlmenit, kolom yang digunakan adalah kolom
kapiler capilary
column yang
panjangnya 60
cm dan
diameter dalam 0,25 mm dengan tebal lapisan film 0,25 µm. Temperatur terprogram yang digunakan adalah suhu 190
o
C yang dipertahankan 15 menit, kemudian suhu dinaikkan hingga suhu akhir 230
o
C yang dipertahankan 20 menit, suhu injektor 200
o
C dan suhu detektor 230
o
C. Mekanisme kerja kromatografi gas disajikan pada Gambar 6.
a b
Gambar 5 a kromatografi gas b rekorder
Untuk analisis kuantitatif dapat dihitung dengan cara:
Asam lemak = Konsentrasi sampel X 100 100-Konsentrasi pelarut
Gambar 6 Mekanisme kerja kromatografi gas
Sumber: Prasastyane 2009
Kondisi alat GC pada saat analisis: a
Jenis kolom : Cyanopropil methyl sil capilary column
b Panjang kolom
: 60 cm c
Diameter dalam : 0,25 mm
d Tebal lapisan film
: 0,25 µm e
Laju alir N
2
: 20 mlmenit f
Laju alir H
2
: 30 mlmenit g
Laju alir udara : 200-250 mlmenit
h Suhu injektor
: 200
o
C i
Suhu detektor : 230
o
C j
Suhu terprogram : 190
– 230
o
C Pengendali aliran
Injektor
Perekam rekorder Detektor
Gas pembawa tabung
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Karakteristik Kerang Bulu Anadara antiquata
Kategori