senyawa antibakteri. Tahap kedua bertujuan untuk menentukan waktu optimum produksi senyawa antibakteri dari isolat terpilih. Tahap ini meliputi kultivasi
isolat terpilih, pengukuran kadar asam laktat dan uji aktivitas senyawa antibakteri dari isolat terpilih.
3.3.1 Kultivasi
Tahap awal kultivasi dilakukan dengan mempersiapkan media pertumbuhan untuk bakteri asam laktat BAL. Refresh isolat BAL atau proses
peremajaan biakan dilakukan dengan menggoreskan isolat BAL dari gliserol ke media MRSA miring dan diinkubasi pada keadaan semi anaerob dengan suhu
37
o
C selama 48 jam. Pembuatan inokulum dilakukan dengan mengambil 1 ose BAL dari MRSA miring kemudian diinokulasikan dalam 10 ml MRSB. Setelah
itu diinkubasi dengan shaker water bath pada suhu 37
o
C selama 18 jam hingga OD
660
inokulum mencapai 0,6-0,8. Sebanyak 10 inokulum diinokulasikan dalam medium produksi MRSB
dengan volume kerja 90 ml dalam botol schott. Kemudian media MRSB tersebut diinkubasi dengan water bath shaker pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Pegamatan yang dilakukan adalah pengukuran pH dan OD awal sebelum inkubasi dengan
shaker water bath dan pengukuran pH dan OD akhir setelah diinkubasi selama 24 jam.
3.3.2 Pemanenan
Setelah kultur diinkubasi selama 24 jam dilakukan tahap pemanenan. Kultur disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm dengan suhu 4
o
C selama 15 menit. Proses sentrifugasi akan menghasilkan pemisahan antara supernatan dan
biomassa. Supernatan tersebut kemudian diberi tiga perlakuan, yaitu 1 tanpa dinetralkan, 2 dinetralkan dengan NaOH 1 N dan 3 dinetralkan kemudian
diendapkan dengan NH
4 2
SO
4
sebesar 50. Tahap purifikasi parsial bakteriosin presipitasi protein ini akan menghasilkan ekstrak endapan Purwanti 2003.
Kemudian supernatan dengan perlakuan 1 dan 2 difiltrasi dengan menggunakan milipore filter dengan ukuran pori 0,2 µm sehingga diperoleh
supernatan bebas sel. Supernatan pada perlakuan 3 diendapkan selama 24 jam dalam refrigerator. Supernatan tersebut kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 rpm dengan suhu 4
o
C selama 30 menit. Kemudian endapan
yang diperoleh dilarutkan dengan larutan buffer fosfat 0,1 M dengan pH 7 Lampiran 1. Penambahan substrat kasar bakteriosin dengan buffer fosfat
bertujuan agar mengurangi bahan pengekstrak yang terikat pada molekul protein Wijaya 2002 diacu dalam Magdalena 2009.
3.3.3 Uji aktivitas senyawa antibakteri
