yang diperoleh dilarutkan dengan larutan buffer fosfat 0,1 M dengan pH 7 Lampiran 1. Penambahan substrat kasar bakteriosin dengan buffer fosfat
bertujuan agar mengurangi bahan pengekstrak yang terikat pada molekul protein Wijaya 2002 diacu dalam Magdalena 2009.
3.3.3 Uji aktivitas senyawa antibakteri
Isolat bakteri uji berupa Listeria monocytogenes, Escherichia coli dan Salmonella typhimurium disegarkan kembali dalam media NA miring selama
18 .
jam. Kemudian bakteri indikator diinokulasi dalam 10 ml NB dan diinkubasi dengan shaker water bath pada suhu 37
o
C selama 18 jam. Sebanyak 20 µl bakteri uji dengan OD 0,6-0,8 dipindahkan ke dalam 20 ml media MHA cair dengan suhu
media 40
o
C. Campuran media MHA cair dan bakteri uji dituangkan ke dalam cawan petri steril. Uji potensi senyawa antibakteri dari bakteri asam laktat
dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumur agar agar well diffusion. Media agar yang telah padat dibuat sumur dengan menggunakan pipet Pasteur
steril berdiameter 5 mm. Kemudian sebanyak 50 µl supernatan steril dimasukkan ke dalam masing-masing sumur yang telah dibuat, lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Kemudian dilakukan pengukuran diameter zona bening pada
masing-masing bakteri indikator. Zona bening yang dihasilkan di sekeliling sumur menunjukkan adanya daya hambat. Areal penghambatan diukur berdasarkan
diameter areal bening yang terbentuk di sekitar sumur Hilmi dan Yusuf 2000 diacu dalam Nurmalis 2008. Diagram alir penapisan senyawa antibakteri dari tiga
isolat BAL yang berbeda dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2 Diagram alir penapisan senyawa antibakteri dari tiga isolat BAL yang berbeda.
Sentifugasi 10.000 rpm suhu 4
o
C; 30 menit Filtrasi dengan
millipore filter Filtrasi dengan
millipore filter Tidak
dinetralkan Dinetralkan dengan NaOH
dan diendapkan dengan NH
4 2
SO
4
50 Dinetralkan
dengan NaOH
Supernatan aktif asam A
Supernatan aktif setelah
dinetralkan N Endapan ditambahkan
larutan buffer fosfat Supernatan aktif hasil
pengendapan E Uji aktivitas senyawa
antibakteri Kultur disentifugasi 10.000 rpm pada
suhu 4
o
C selama 15 menit Biomassa
Supernatan Kultivasi dalam 90 ml MRSB, shaker
pada suhu 37
o
C selama 24 jam; ukur OD dan pH awal dan akhir kultivasi
Refresh isolat BAL dalam MRSA, inkubasi pada suhu 37
o
C selama 48 jam Isolat BAL
Inokulasi dalam 10 ml MRSB, shaker pada suhu 37
o
C selama 18 jam
3.3.4 Kultivasi isolat terpilih
